生命经纬知识库 >>所属分类 >> 分子生物学技术   

Northern Blot(Northern杂交)

标签: Northern Blot

顶[1] 发表评论(5) 编辑词条

 

目录

[显示全部]

RNA的提取与检测编辑本段回目录

细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA,其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源,是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的,为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量,通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养,如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取细胞总RNA的方法,常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞,我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法,但不纯,本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏,核蛋白二级结构破坏,可利于提取总RNA,也可从总RNA中提取mRNA,从而分析mRNA表达量,建立cDNA文库,以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。
变性液:7mol/L盐酸胍,25m mol/L棕檬酸钠pH7.0,0.5%Sarkosye,0.1mol/L β-巯基乙醇。
水平衡酚:在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相,再重复处理二次即可。
所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌,其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时,以去除被污染的RNA酶。
(一)总RNA的提取方法:
1、消化收集细胞方法同前。
2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液,立即充分混匀。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿,剧烈振荡混匀30秒后,立即置冰上放置15分钟,4℃ 12000r/min离心15分钟。
4、取水相,加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀,剧烈振荡10分钟,4℃12000rpm离心15分钟。
5、取水相,加入等体积氯仿,剧烈振荡10分钟,再同上离心,再如此反复抽提一次后取水相,加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀,低温放置20分钟,再同上离心。
6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次,干燥10分钟,溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA,分装,-20℃冻存。
(二)总RNA的鉴定及含量计算
1、RNA纯度及含量测定
取少量提取的RNA,经紫外线扫描,吸收峰位于波长260nm处,RNA纯度为OD260/OD280=1.8~2。
OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL,故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。
2、RNA分子量大小鉴定
2.1  配液:
(1)10×MOPS电泳缓冲液配制
将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱,2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中,用2mol/L NaoH调整pH至7.0,加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0),再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌,避光室温保存。
(2)甲醛加样缓冲液:1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、
                   50%甘油
2.2  操作步骤:
(1)制平板胶:1.2%琼脂糖煮沸,冷却至60℃,加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液,使三者的比例为3.5:1.1:1,或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%,于室温放置30分钟或更长时间,使胶凝固。
(2)在无菌离心管中混合下列液体。
    RNA(最多30μg)          4.5uL
    10×MOPS电泳缓冲液     1.0uL
    甲醛                   3.5uL
    65℃温育15分钟,水浴冷却、离心
(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样,进行电泳,5V/cm电压,3小时直到溴酚兰至胶的中部,可用已知RNA标本作分子量标准品,如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)电泳完毕,取出凝胶,浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30~45分钟,紫外透射仪观察分子量大小。

 

RNA Northern Blot编辑本段回目录


此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离,随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上,用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交,此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一,可测量RNA的含量和大小。
1、配液:Northern 预杂交液:12.5m  1mol/L K3PO4 pH7.4
                            125mL   20×SSC
                            25mL    100×Danhardt's液
                            5mL     5mg/mL 鱼精DNA
                            250mL   100%去离子甲酰胺
                            加H2O   至500mL-20℃贮存
    Northern 杂交液:500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步骤:
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时,用水清洗胶数次,放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟,轻轻摇动。
(3)测量胶的大小,按下列顺序,从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸,双边可浸至20×SSC溶液;②胶;③硝酸纤维素滤膜;④亲和层吸纸;⑤吸水纸;⑥重物、转移4~6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6~10mL Northern预杂交液,42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸,立即冷却,加入6~10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液,加入含探针的杂交液,42℃,杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜:1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
                   0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影,定影,根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序,也可测含量。

 

Northern杂交操作指南编辑本段回目录


RNA变性处理电泳
1)在灭菌的微理离心管内,混匀下列液体:
6mol/L乙二醛 5.4μl
DMSO 16.0μl
0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl
RNA(多达10μl) 5.4μl市售乙二醛通常为40%溶液(6mol/L)。 由于接触空气的后乙二醛易于氧化,所以使用前需通过混合床树脂(Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理,直至溶液pH值大于5.0为止,然后可分装在小份, 用盖紧的小管贮存于-20℃。每小份乙二醛溶液只用1次,剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠(pH7. 0)的配法如下:将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合,用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA,通常用10- 20 μg 细胞总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上),如等测RNA含量极微,每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2)将微量离心管盖严,将RNA溶液置于%0℃温育50℃温育60分钟后, 用冰水浴冷却样品,离心5秒钟,使管内所有液体沉降至管底。
3)于50℃温育RNA溶液的同时,灌制琼脂糖水平凝胶,用1.4 %琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品, 而用1%琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。 用0mmol/L 磷酸钠(pH7. 0 )后, 降温至70 ℃, 加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L(使RNA酶失活),再降温至50℃,制胶,加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净,用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%H2O2,于室温放置10分钟后,用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应,所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。
4)将RNA样品冷却至0℃,加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛-DMSO凝胶中样缓冲液,随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物,如用18S和28S rRNA或或9S兔β-珠蛋白mRNA,上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘,便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色,可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。
乙二醛-DMSO凝胶加样缓冲液
50%甘油
10mmol/L磷酸钠(pH7.0)
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
5)将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中,以3-4V/cm电压降进行电泳,同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环,使溶液pH值维持在可被接受的限度 内(pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离)。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。
6)电泳结束后(溴酚蓝迁移出区8cm),切下分子量标准参照物的凝胶条,浸入溴化忆锭溶液(0.5μg/ml,
    用0.1mol/L乙酸铵配制)中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟,在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离,以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图,用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。
7)RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜,将RNA转移至尼龙膜。
将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜
电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜,有以下几种转移方法:毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。
1)将凝胶移至一个玻璃皿内,用锋利刀片修凝胶的无用部分,在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角,以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
2)用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台,将其放入大千烤皿内,上面放一张Whatman 3MM滤纸,倒入20xSSC使液面略低于平台表面,当平上方的3MM滤纸温透后,用玻棒赶出所有的气泡。
3)用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜(Schleicher &Schuell BA85或与之相当的产品)。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm, 接触滤膜时须戴手套或用平头镊子(例如Millipore镊子),用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。
4)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面,直至滤膜从下向上湿透为止,随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟,用干净的解剖刀片切去滤膜一角, 使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜,其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透,应另换一张新滤膜,因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃,可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间, 高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间,装入塑料袋, 密封后于4℃保存备用。
5)将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央,3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。
6)用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边,但不是覆盖凝胶, 以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾,易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触,这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。
7)在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜,并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后,就不应轻易移动,滤膜与凝交之间不应留有气泡。
8)用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸, 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。
9)切一叠(5-8cm高)略小于3MM滤纸的纸巾,将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板,然后用-500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路,以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。
10)使上述RNA转移持续进行6-18小时,每当纸巾浸湿后,应换凝的纸巾。
11)转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸,翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜,以凝胶的一面在上,置于一张干的3MM滤约纸上,用一支极软铅笔或圆珠笔,在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。
12)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟,这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜,将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率, 可将胶置于溴化乙锭溶液(0. 5 μg/ml , 以0.1mol/L乙酸铵配制)中染色45分钟,于紫外灯下观察。
13)将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间,用真空炉于80℃干烤0.5-2 小时。如干烤时间过长,滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验,可用铝箔宽松地包裹起来,在真空下贮存于室温。
14)仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况:杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜,除去RNA上的乙二醛分子。
转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色
当RNA自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前,溴化乙锭的染色时间一般不宜过长,这是因为被染料饱和的核酸分子,其转移效率有所降低。然而,用溴化乙锭作短暂染色,既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用,又独具同时检测凝胶和凝膜上的RNA的优点。
杂交和放射自显影
固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件,与DNA杂交的相应条件基本相同。现简述如下:
1)用下列两种溶液之一进行预杂交,时间1-2小时。若于42℃进行,应采用。
50%甲酰胺
5xSSPE
2xDenhardt试剂
0.1%SDS
若于68℃进行,应采用:
6xSSC
2xDenhardt试剂
0.1%SDS
2)在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA, 所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2x108计数/(分.μg)在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。切记RNA只与双链DNA中一条单链互补,因此如用单链探针, 则必须是能与RNA互补的一条单链。
3)用1xSSC、0.1%SDS于室温洗漠20分钟, 随后用0.2xSSX、 0.1%SDS于68℃洗膜3次每次20分钟。
4)用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影, 附加增感屏于-17℃曝光24-48小时。

Northern Blot详尽试验程序及注意事项编辑本段回目录


一、 RNA提取
方法一、改良异硫氰酸胍提取法
试剂及其配制
异硫氰酸胍变性液:
贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍,加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。
工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为:
4mol/L异硫氰酸胍
25mol/L柠檬酸钠pH 7.0
0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)
0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)
其它溶液:
2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)
水饱和酚(pH 3.5)
49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇
100%异丙醇
70%乙醇(用DEPC处理水配制)
DEPC处理后高压灭菌水

试验程序
1.取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中,加入液氮,迅速研磨成均匀的粉末。
2.将粉末全部移入冰上预冷的离心管中,并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液,轻轻摇动离心管使混合均匀。
3.顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml,每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀,最后将离心管盖紧,倒转几次混合均匀,冰浴15min.。
4.4℃条件下15000g离心30min.,将上层水相转移至另一干净的离心管中,并加入等体积的异丙醇,混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
5.4℃条件下13000g离心25min.,小心去除上清液,沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中(体积为第一次变性液的1/3),再加入等体积的异丙醇,混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
6.4℃条件下13000g离心20min.,沉淀用70%乙醇洗一次,晾干后溶于适量体积(50μg/100μl)的DEPC处理水中,检测后分装,置于-70℃低温条件下保存。

注意事项
RNA提取过程中,为了保证所提取的RNA的纯度和完整性,其中有两个方面的问题需要特别控制,一是去除与RNA结合的蛋白质,二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中,常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠(SDS)等。为防止外源Rnase的污染,所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌,所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染,所有试验操作均应带手套,避免人体接触所有用品。

方法二、改良Krapp提取法
试剂及其配制
RNA抽提掖:
母液:4mol 异硫氰酸胍
20mmol EDTA
20mmol MES
pH 7.0
工作液:取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。
RNA重悬液:2mol LiCl
10mmol NaAc
调整终体积为250ml,pH 5.2,灭菌后贮存在4℃条件下备用。

试验程序
1. 取新鲜植物材料0.5~1g,冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨,然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。
2.4℃条件下8000rpm离心10min.,将上层水相转移至一干净离心管中,加入等体积的酚/氯仿抽提掖,在4℃条件下8000rpm离心10min.。
3.上清液转移至一干净离心管中,再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混匀后,在4℃条件下8000rpm离心10min.)。
4.小心将上清液转移至另一干净离心管中,加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇,在-80℃条件下沉淀2小时。
5.在4℃条件下8500rpm离心30min.,小心弃去上清液,沉淀重悬于RNA重悬液中,置于4℃条件下1小时。
6.4℃条件下8500rpm离心10min.,弃去上清液,沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装,置于-70℃条件下保存。


二、RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。
方法一、紫外吸收检测
试剂:TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。
dH2O

试验程序
1.预热紫外分光光度计10~20min.。
2.取两个1ml的狭缝石英杯,一个装入1mlTE溶液作为空白校正液,用来校正分光度计零点及调整透光度至100。
3.取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中,加dH2O至1ml,用无菌石蜡膜堵住杯口,倒转混匀。
4.将两个比色杯置于分光光度计中,调入射光波长,用空白溶液分别调整T至100、OD至0,然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。

RNA浓度和纯度分析
浓度计算:对于单链RNA,OD260=1.0时,RNA浓度为40μg/ml,按照上述稀释方式,即OD260=0.1时,其RNA浓度为1μg/ml。
纯度分析:纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0,小于此比值说明有蛋白或苯酚污染,如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染;OD260/OD230比值应大于2.0,如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。

方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测
试剂及其配制
MOPS缓冲液(10×): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA,先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc,再将MOPS溶解其中,再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA,混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0,最后定溶至1000ml,过滤灭菌后避光保存。
上样染料:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝
其它试剂:甲醛(37%溶液,13.3mol/L)
甲酰胺(去离子)
将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合,室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。
溴化乙锭(EB,10mg/ml)
70%乙醇

试验程序
1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
2.配制琼脂糖凝胶:称取0.5g琼脂糖,置于干净的烧瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热溶化均匀。
3.待胶凉至60~70℃时,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭,混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。
4.样品制备:取DEPC处理过的500μl小离心管,依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺(去离子)10μl、RNA样品4.5μl,混合均匀;将离心管置于60℃水浴中保温10min.,再置于冰上2min.;向每管中加入3μl上样染料,混匀。
5.上样:将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极),加入电泳缓冲液(1×MOPS缓冲液),液面高出胶面1~2mm,小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔,每孔上样20~40μl。
6.电泳:盖上电泳槽,接通电源,样品端接负极,于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右,当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后,即可在紫外灯下检测结果。

RNA样品质量分析:
完整的总RNA样品应呈现出三条条带,分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍,这表明RNA样品比较完整,基本无降解。如果两条带的亮度反过来,则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带,则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率,以此可作为分子量的参考。


三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆
A. 载体选择
为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板,其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子,同时,为了获得理想的Northern杂交试验结果,载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体,以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有:pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照试验的经济有效原则,本试验选用 Bluescript M13。

B. 目的DNA序列与载体连接
从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆,扩增后提取质粒,采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断;采用标准质粒提取方法提取载体质粒。然后按下列程序进行连接。

试剂及其制备
T4 DNA连接酶
连接缓冲液(可直接购买或配制),10X 缓冲液配方为:
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)
ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液,有的已加在缓冲液中,但有些需单独加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可,在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水(SDW)

试验程序
1. 建立以下反应体系(终体积20μl):
4μl 质粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 连接缓冲液
2μl DNA 连接酶
6μl 无菌蒸馏水
2. 反应管置于15℃条件下保温反应24小时,65℃加热10min.终止反应。
3.取5~10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果,其余反应物于-20℃保存备用。

注意事项
1.保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1,因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接,低浓度的DNA则会增加载体自连。
2.DNA连接酶对温度敏感,在15℃以上会迅速失活,因此,连接反应的温度控制必须严格。
3.为了保证RNA探针的质量,模板DNA片断的完整性和纯度十分重要,在DNA制备时要严格控制。

C.感受态细胞制备(CaCl2法)
试剂及其配制
LB培养基(200ml):2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl,溶解后调整pH至7~8,定溶到200ml混匀,分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl2 0.1mol/L,4℃保存。
E. coli菌株:JM105或TG1。

试验程序
1.将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中,在37℃条件下振荡培养过夜。
2.取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中,在37℃条件下振荡培养约3小时,用分光光度计检测OD600=0.3~0.4时,取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3.将菌液转入离心管中,在4℃条件下,3500rpm离心5~10min.,弃去上清液。
4.将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中,在冰上放置30min.后,于4℃条件下,3500rpm离心5~10min.,弃去上清液。
5.沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中,菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油,按每管200μl分装于2ml的冻存管中,于液氮中速冻后-70℃保存备用。

D. 质粒DNA转化
试剂及其配制
LB培养基(同C)。
氨苄青霉素:用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素(AP)的LB平板:每升LB培养基中加入15g琼脂,溶化后高压灭菌,待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):取2g溶于8ml双蒸水中,定容至10ml,过滤灭菌后-20℃保存。
X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷):贮存液浓度为20mg/ml,溶于二甲基甲酰胺中,-20℃黑暗保存。

试验程序
1.取制备分装好的感受态细胞,置于冰上5min.,加入连接产物10μl,轻轻混匀后置于冰上30min.。
2.然后置于42℃水浴中热击细胞50s.,再置于冰上2min.。
3.向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基,37℃下振荡培养1小时。
4.与此同时,将LB平板置于37℃下片刻,每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。
5.将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上,吹干后(在超净工作台中放置片刻)置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。

E. 转化质粒的快速检测
试剂及其配制
煮沸缓冲液:蔗糖 8%
Triton X-100 1.5%
EDTA(pH 8.0) 50mmol/L
Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L
LB培养基(同C)
氨苄青霉素(AP)(同D)

试验程序
1.选取白色单菌落,接种到3ml含AP的LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜。
2.将培养物等分成2份按菌落编号,每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用,每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中,7000rmp离心2min.,弃去上清液,吸干残留液体。
3.将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中,加入25μl溶菌酶后,涡旋混合。
4.将管置于100℃沸水中煮40s.,取出立即在12000rmp条件下离心15min.。
5.取10μl上清液,加入溴酚蓝染料后,在0.8%琼脂糖胶上电泳。
6.在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。

如果不能确定转化片断的大小,则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落,转接于2ml TB培养基(每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠)中,37℃下振荡培养过夜,取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中,再加入150μl 50%的甘油,混匀后置于液氮中快速冷冻,再置于-70℃条件下保存。

四、模板DNA的制备
A.质粒DNA的小量提取
试剂及其配制
含AP的LB液体培养基
TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
溶液I: 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)
10mmol/L EDTA
50mmol/L 葡萄糖
高压灭菌15min.后,4℃贮存。
溶液II: 0.2mol/L NaOH
1% SDS(临用前现配制)
溶液III(100ml):5mol/L 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
dH2O 28.5ml
4℃贮存。
酚∶氯仿(1∶1)
95%和70%乙醇

试验程序
1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中,然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中,37℃下振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中,在4℃下12000rpm离心2min.,弃去上清液,使细菌沉淀尽可能干燥。
3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中,剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II,盖紧离心管口,将其快速颠倒5次(切勿振荡),再加入150μl在冰上预冷的溶液III,盖紧离心管口,将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀,再将离心管置于冰上3~5min.。
4.在4℃下12000rpm离心5min.,将上清液移至另一离心管中。
5.加入等量酚∶氯仿(1∶1),振荡混匀,在4℃下12000rpm离心2min.,将上清液转入另一离心管中。
6.加入二倍体积95%乙醇,振荡混匀,室温放置20min.,在4℃下12000rpm离心5min.,小心弃去上清液,倒置将液滴除尽。
7.用70%乙醇洗涤一次,室温干燥10min.,用50μl含20μg/ml胰RNA酶(无DNA酶)的TE重新溶解质粒DNA,取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测,其余置于-20℃保存备用。

B. 质粒DNA的线性化
试剂及其配制
Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿(1∶1)
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
DEPC-H2O

试验程序
1.在离心管中依次加入:质粒DNA 10μl (1μg/μl)
10×内切酶缓冲液 10μl
dH2O 80μl
Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2.37℃保温反应2小时以上。
3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次,每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4.将上清液转入一新的离心管中,加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5.4℃下12000rpm离心20min.,弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤一次,真空干燥。
6.线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中,取10μl电泳检测线性化质量,其余于-20℃下保存备用。

五、RNA探针制备(根据the DIG system user's guide)
A. 地高辛标记的体外转录
试剂及其配制(试剂盒提供):
10× NTP标记混合物:in Tris-HCl (pH 7.5)
10mmol ATP
10mmol CTP
10mmol GTP
6.5mmol UTP
3.5mmol DIG-UTP
10× 转录缓冲液:400mmol Tris-HCl(pH 8.0)
60mmol MgCl2
100mmol DTE(dithioerythritol)
20mmol亚精胺
100mmol NaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μl DNase I (RNase-free)
20unit/μl Rnase抑制剂
20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶
4mol/L LiCl
200mmol/L EDTA
DMPC-H2O

试验程序(带手套操作)
1.在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物(离心管置于冰上):线性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP标记混合物 2μl
10×转录缓冲液 2μl
DMPC-H2O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2.轻轻混匀反应物,37℃保温反应至少2小时。
3.如果必要,向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI,37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板(由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量,因此,这一步有时也可以省略)。
4.向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5.再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇,4℃下沉淀过夜
6.4℃下,12000rpm离心15min.,沉淀用70%冷乙醇洗涤一次,真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中(每一反应体系约10μg),并向其中加入20unit Rnase抑制剂,置于-20℃保存备测,检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B. DIG标记有效性检测

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测,有两种方法可以选择。

方法一、用标准DIG测试条比较鉴定
使用测试条鉴定包括两个步骤:首先,将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度,并点样到空白测试条上(对照测试条已用一系列浓度点样);其次,将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应,然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。
试剂及其配制
20×SSC:3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O(88g/L)
pH 7.0
RNA稀释缓冲液:DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液:75mg/ml NBT溶解在DMF(二甲基甲酰胺)中
BCIP溶液:50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条:带正电荷的尼龙膜
对照试剂条:在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样(300,100,30,10,3pg)
洗膜缓冲液:100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid缓冲液:100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封闭液:5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存,如果需要,用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液:100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液:10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA

试验程序(带手套操作)
1.将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml,即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液,如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。
2.取5支Eppendorf管,按A、B、C、D、E顺序编号,将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度:

编号 RNA标记物稀释方法 RNA终浓度
A 1μg/mlRNA 10μl+RNA稀释缓冲液23μl 300pg/μl
B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C A 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 30 pg/μl
D B 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
E C5μl + RNA稀释缓冲液45μl 3 pg/μl

3.将空白测试条置于一聚酯膜上,以每一浓度1μl的量在测试条上点样,在聚酯膜上做好点样浓度标记,切勿直接在测试条上做任何记号,切勿用手接触测试条。
4.室温干燥约2min.,同时制备测试溶液。
5.在2ml封闭液中加入1μl Anti-DIG-AP。
6.显色底物溶液:在2ml检测缓冲液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。
7.准备5个样品池(2.5 ~ 5ml容量),1~6顺序编号,依次加入2ml以下溶液。
①. 封闭液;
②. 抗体溶液;
③. ③④⑤洗膜缓冲液;
④. 检测缓冲液;
⑤. 显色底物溶液)

8.将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理,两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①. 封闭, 2min.→
②. 抗体结合, 3min.→
①. 封闭, 1min.→
③. 洗膜, 1min. →
④. 平衡, 1min. →
⑤. 显色反应(黑暗),5-30min.
9.显色反应30min.即停止反应(延长显色反应时间,会增加背景而影响结果比较),用水漂洗测试条,将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥,然后在光下检测。

结果评估

显色反应进行5~10min.时,对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色,30min.时3pg的样点也可见颜色,随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色,根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。
如果标记物浓度低于10-30pg则不适宜采用这一快速检测方法。

方法二、用DIG标记的RNA对照比较检测
试剂:DIG标记的对照RNA(浓度约为100μg/ml)
其它试剂同方法一

试验程序
1.将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl(5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O),取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号,将对照按下列比例稀释成一系列浓度:

编号 对照RNA稀释方法 终浓度
A 20ng/μl RNA 2μl+RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl
B A 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C B 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
D C 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl
E D 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl
F E 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl
* 稀释后的A-E可以在-70℃下至少贮存一年。
2.按照同样的方法将待测的DIG-RNA也稀释成一系列浓度,编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.取一片尼龙膜,按照前述方法一的方法点样,第一排点对照,第二排点待测样,不必从浓度A开始,只需点C-F浓度进行检测。
4.用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上,再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5.将膜置于封闭液中,室温下封闭30min.。
6.准备抗体溶液:用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7.将膜置于抗体溶液中,室温下保持30min.,注意抗体溶液必须没过膜。
8.室温下用洗膜缓冲液洗膜2次,每次15min.。
9.再将膜置于检测缓冲液中2min.。
10.在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液(现配现用)。
11.除去检测缓冲液,加入显色底物溶液,在黑暗下显色大约16小时(一般几分钟即可见开始显色),注意在显色过程中,切勿振荡样品盘。
12.当颜色沉淀充分后,停止显色反应,用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。
13.比较对照和样品的颜色测算浓度。

六、Northern 印迹杂交
A. 探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比,显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景,因此,只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针,建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前,优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜,将其浸入不同探针浓度的溶液中(如:1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …),可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时,建议试验探针浓度50-100ng/ml,如果采用CDP-Star化学发光检测,由于灵敏度很高,在此探针浓度下会产生很高的背景,因此,要适当降低探针浓度。

B. 印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜,在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果,转膜时间是在4℃或室温下过夜。

C. 试剂及其配制
MOPS缓冲液(10×): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
上样染料:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝
甲醛(37%溶液,13.3mol/L)
染液:0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝
甲酰胺(去离子)
70%乙醇
SSC(20×):3mol/L NaCl (175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)
用1mol/L HCl调整至pH 7.0
Denhardt溶液(100×):10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)
用DSPC处理水溶解,定容至500ml,过滤后分装成每份25ml
于-20℃保存。
预杂交溶液:5× SSC
5× Denhardt 溶液
50%(w/v) 甲酰胺
1%(w/v) SDS
100μg/ml 鲑鱼精DNA(用前加热变性后加入)
杂交溶液:DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液:2×SSC 加入0.1% SDS
0.5×洗膜缓冲液:0.5× SSC加入0.1% SDS
0.1×洗膜缓冲液:0.1× SSC加入0.1% SDS

D. Northern转膜
转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法,根据需要选用适当的 分子量Marker.
1.在一个标准变性凝胶电泳完成后,凝胶用DMPC-H2O淋洗,以除去甲醛,然后置于 2×SSC(20×SSC用DMPC-H2O稀释)中浸泡15~30min.。
2.构建转移平台:在塑料盒上横放一块玻璃板,玻璃板应比塑料盒长,但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸,将其横放在玻璃板上,滤纸两头垂入盘中,用20×SSC浸湿滤纸,并向盘中加入足量的20×SSC。
3.用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去,并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央,用玻棒滚动除去气泡,然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘,避免覆盖样品部位。
4.剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜,在无RNase的水中浸泡5min.,然后将其放置在凝胶上面,膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动,膜与凝胶之间不应留有气泡。
5.取两张与尼龙膜同样大小的滤纸,用20×SSC浸湿后置于膜的上方,用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾,将其置于滤纸上方,在纸巾上平放一玻璃板,然后在玻璃板上压一重物,室温下转膜4~6小时或4℃过夜。
在转膜过程中,要保证塑料盘中有足够的20×SSC,当纸巾浸湿后,要及时更换。
6.拆卸转膜装置,翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上,置于一张干的滤纸上,用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
7.取下凝胶,用2×SSC洗膜,再置于两张干滤纸上使膜晾干。
8.交联:方法1. 将膜夹于两张滤纸之间,在80℃真空烘烤0.5~2小时;方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中,将有RNA的一面朝下,用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜,总照射剂量为1.5 J/cm2,而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。
9.转膜效果检测:如果需要,可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中,于室温浸泡15min.,再将膜转移至亚甲蓝染液中,室温下浸泡5~10min.。可见明显的5s和18s两条RNA带,mRNA呈现模糊带型。

E.杂交
建议杂交条件:探针浓度50~100ng/ml,温度68℃过夜。
1.将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中(每100cm2膜20ml预杂交液),封好杂交袋,在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。
2.将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性,立即使用),用预杂交液稀释成设定浓度。
3.将杂交袋中预杂交液弃去,加入稀释好的含有探针的杂交液,在设定杂交温度条件下(68℃)杂交过夜。
4.杂交完成后,将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中,贮存于-70℃以备重复使用。重复使用时,解冻并在68℃下变性10min.。
5.洗膜:杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次,每次15min.,除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次,每次15min.,洗膜温度42℃,然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次,每次15min.,洗膜温度68℃。当探针长度小于100bp时,最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。

七.杂交结果检测
方法一、化学发光检测
试剂及其配制:
洗膜缓冲液:100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid缓冲液:100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封闭液:5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存,如果需要,用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液:100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液:10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
Anti-DIG-AP
CSPD: 25mmol CSPD(用前稀释)

检测程序:
1.杂交洗膜后,将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。
2.将化学发光底物置于室温下。
3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30~60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动),在封闭快结束时,按下列方法准备抗体溶液。
4.在第一次使用时,Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体,以免造成背景过高,以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶10000),3μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。
5.在封闭完成后倒出封闭液,加入稀释好的抗体溶液,浸膜至少30min.。
6.去除抗体溶液,用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次,每次15min.。
7.去除洗膜缓冲液,在检测液中平衡膜2次,每次2min.。注意:在使用化学发光底物处理之前,膜必须保持湿润,哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。
8.用检测缓冲液稀释CSPD(1∶100),选择以下方法的一种进行发光底物处理:
a. 单张杂交膜处理:将膜置于一保鲜袋中或两张醋酸纸之间,用镊子轻轻抬起一角,用一消毒的吸管从膜顶端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化学发光底物,让底物溶液均匀扩散到膜的表面,然后将膜放平,用一张湿润的滤纸轻轻排除气泡使膜四周被液体封闭,室温下放置5min.,然后接步骤9。
b. 成批膜处理:取一个干净的盘子,用消毒吸管取5~10ml底物溶液于盘中,用一钝头镊子将膜置于其中,轻轻倾斜盘子直到膜表面全部浸有底物溶液,室温下放置5min.,用镊子小心夹住膜的一角,提起使多余液体滴出(切勿使膜干燥),然后将其置于一干净保鲜袋中。重复以上过程将膜一张一张全部处理完后接步骤9。
9.当膜半干燥时,即刻将膜封闭在保鲜袋中。为了缩短曝光时间,膜需在室温下稳定7~8小时或37℃下15min.,达到稳定态的膜单拷贝基因的检测也只需曝光15min.,如果封膜后马上曝光处理,则曝光时间要60min.。

方法二、NBT-BCIP荧光检测
试剂:Anti-Dig-AP
NBT
BCIP
其它同化学发光检测。

试验程序:
1.杂交洗膜后,将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。
2.将化学发光底物置于室温下。
3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30~60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动),在封闭快结束时,按下列方法准备抗体溶液。
4.在第一次使用时,Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体,以免造成背景过高,以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000),6μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。
5.在封闭完成后倒出封闭液,加入稀释好的抗体溶液,浸膜至少30min.。如果是在保鲜袋中处理,要排除气泡;如果在盘子中进行处理,要轻轻摇动,使膜全部浸入抗体溶液中。
6.去除抗体溶液,用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次,每次15min.以除去非结合抗体。
7.与此同时,准备颜色底物溶液,在10ml检测缓冲液中混合45μl NBT和35μl BCIP,注意避免直接暴露在光下。
8.去除洗膜缓冲液,在检测液中平衡膜2次,每次2min.。
9.除去检测缓冲液,加入大约10ml颜色底物溶液,显色反应可以在保鲜袋中进行,也可以在暗盒中进行,显色反应中切勿摇动。在显色反应中,可以短时暴露于光下观察,一般几分钟后开始显色,但完全反应大约需要12小时。
10.显色完成后,用H2O洗膜以终止反应,如果膜还要再用则用TE终止反应。
结果记录可采用影印和照相的方法,膜如果贮存在TE中可长期保存颜色不变。

实验:Northern印迹杂交编辑本段回目录

实验目的
    学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。
实验原理
    Northern印迹杂交是Southern印迹杂交的基础之上发展而来的一种技术。其基本原理是:将RNA样品通过琼脂糖凝胶进行分离,再转移到固相支持载体上,用同位素或生物素标记的探针对固定于膜上的mRNA进行杂交,将具有阳性信号的位置与标准分子量分子进行比较,可知此mRNA的分子量大小,根据杂交信号的强弱进行比较,可知基因表达的丰度,因此这一技术广泛应用于基因的表达调控、结构和功能研究。
Northern印迹基本原理与Southern印迹类似,但RNA变性方法与DNA不同,不能用碱变性,否则会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程,此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。RNA膜转移完成后,杂交方法和一般核酸分子杂交类似。
实验内容
材料与试剂
1.待测细胞总RNA或mRNA。
2.杂交探针  同位素32P或生物素标记。
3.5×甲醛凝胶缓冲液:
0.1 mol/L  MOPS(pH 7.0)
40mmol/L  乙酸钠
5mmol/L  EDTA(pH 8.0)
     制备方法:20.6g MOPS溶于800ml用DEPC处理过的50mmol/L乙酸钠溶液中,用2mol/L NaOH调节pH至7.0,然后加入10ml 0.5mol/L EDTA,用DEPC预处理过的蒸馏水调节体积至1000ml,0.2μm微孔滤膜过滤,室温下避光保存。
4.甲醛凝胶上样缓冲液:
1mmol/I  EDTA(pH 8.0)
0.25%  溴酚蓝
0.25%  二甲苯青
DEPC处理并高压灭菌,室温保存。
5. 100×Denhart's溶液,20×SSC,等预杂交、杂交所用试液与Southern印迹相同。

操作步骤
    甲醛变性胶分离RNA样品
1.将适量琼脂糖加热溶于水,冷至60℃,加入5×甲醛胶电泳缓冲液和甲醛,使其终浓度分别为1×和2.2mol/L,在化学通风橱内灌制凝胶(电泳槽必须彻底冲洗干净)。
2.取1个Eppendorf管,按以下体积配制样品:
4.5μ1  RNA(总RNA30μg,mRNA0.3~3μg)
        2.0μ1   5×电泳缓冲液
3.5μ1  甲醛
10.0μ1 甲酰胺
置65℃保温15min,迅速置冰浴中,稍稍离心。
3.加入2μ1上样缓冲液。
4.上样前凝胶预电泳5min,然后将RNA样品立即上样于加样孔中,另一加样孔加入标准分子量参照物(常用28SrRNA和18SrRNA)。
5.在1×甲醛胶电泳缓冲液中电泳,恒压3~4V/cm,每1~2h将阴、阳极电泳缓冲液混合一次。
6.电泳结束后,切下分子量标准参照物条带,溴化乙锭染色,紫外线下观察,照相。
Northern印迹
    1.上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。含有甲醛的凝胶可用DEPC预处理过的水漂洗以去除所含的甲醛。如果凝胶较浓(大于1%)、较厚(如大于0.5cm)或待测RNA片段较大(大于2.5kb),可预先将凝胶置0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20min,然后用DEPC处理过的水漂洗,最后用20×SSC浸泡45min。
    2.切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切去,以便于定位。然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
    3.在一塑料或玻璃平台上铺上一层Whatman 3MM滤纸,此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一盛有20×SSC的搪瓷盆中。滤纸的两端要完全浸泡在溶液中。将滤纸用上述溶液浸润,用一玻璃棒将滤纸推平,并排除滤纸与玻璃之间的气泡。
    4.裁剪下一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套,注意不可用手触摸滤膜,否则油腻的膜将不能被湿润,也不能结合RNA。
    5.将硝酸纤维素漂浮在去离子水中,使其从底部完全湿润。然后置于20×SSC中至少5min。
    6.将中和后的凝胶上下颠倒后,置于上述铺上了Whartman 3MM滤纸的平台中央。注意两者之间不要有气泡。
    7.在凝胶的四周用Parafilm封严,以防止在转移过程产生短路(转移液直接从容器中流向吸水纸),从而使转移效率降低。
    8.将湿润的硝酸纤维素膜小心覆盖在凝胶上,膜的一端与凝胶的加样孔对齐,排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触即不可再移动,因为从接触的一刻起,RNA已开始转移。
    9.将两张预先用2×SSC湿润过的与硝酸纤维素膜大小相同的Whatman 3MM滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排除气泡。
    10.裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸,厚5~8cm。将之置于Whatman 3MM滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板,其上压一重约500g的物体。转移液将在吸水纸的虹吸作用下从容器中转移到吸水纸中,从而带动RNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。
    11.静置6~18h使其充分转移,其间换吸水纸1~2次。
    12.弃去吸水纸和滤纸,将凝胶和硝酸纤维素膜置于一干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。
    13.凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡6×SSC溶液中5min以去除琼脂糖碎块。
    14.硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后置于两层干燥的滤纸中,真空下800C烘烤2h。
    15.此硝酸纤维素膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用,可用铝箔包好,室温下置真空中保存备用。
    16.对于聚乙二醛电泳的RNA,在杂交前必须在65℃下用20mmol/L Tris•CI(pH8.0)溶液清洗,以去除聚乙二醛分子。
滤膜杂交
预杂交、杂交过程同Southern印迹。
放射自显影
取出漂洗后的尼龙膜,用保鲜膜包裹。RNA面朝上,置于暗盒中,将一块比杂交膜稍大的X光片压在保鲜膜上。-20℃,黑暗下放射自显影。一段时间(2周后)取出X光片依次进行显影、停影和定影,最后用自来水、双蒸水冲洗后晾干。
注意事项
1.RNA极易被环境存在的RNA酶降解,因此应特别注意。
2.本实验叙述的转膜方法也基本适用于尼龙膜。另外,尼龙膜在碱性条件下与RNA结合,因此可用7.5mmol/L NaOH作为转移液,转移效率会更高。

 

 

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇Western Blot(Western杂交) 下一篇分光光度技术

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
1

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   
已删除
此用户已删除
最近编辑者

相关词条