利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1. 光谱：
光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。
                         λ＝C/ν
λ——波长   C——光速   ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：
E＝h•ν
H——普朗克常数（ 6.624×10-27尔格•秒）
ν——频率
紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：
E＝E¬0+E平+E转+E振+E电
E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：
E＝E2- E1＝h
E¬1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。
可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。
与吸收光谱有关的三种电子是：
⑴ 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键， 构成 键的电子称 σ电子，如C－C、C－H键。
⑵ 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为 π电子，如C=C键。
⑶ 未共享成键的电子，称n电子。
各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：
n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。
如下表所示：
         电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表
电子跃迁类型         例子 紫外吸收波长范围
σ→σ*              C－H        100～150 nm
  π→π*( 非共轭 )             C＝O          ＜200 nm
  π→π*( 共轭 )         ＝C－C＝         200～300 nm
    n→π*             C＝O         ～300 nm
 
         π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。
若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。
⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。
⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、¬肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。
紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。
发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。
助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生  n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。
增色效应（hyperchromic effect）:
核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
减色效应（hypochromic effect）:
在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
2.  光吸收定律：
朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：
                                                                          A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又称光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L•mol－1•cm－1）。
b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C¬——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
摩尔吸光系数：     ， 是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 ε＝10～105：一般认为ε＞ 104为强吸收；ε＝103～104 为较强吸收；ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001, 所以，当b＝1cm,
ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8 mol/L。
常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V），液层厚度b＝1cm时的吸光度，以E1%λmax表示。
 
C——百分浓度（W / V）。
L——液层厚度，吸收杯光径长度。    A——吸光度。
最大吸收波长λmax时的ε 和E1%λmax值可用下式换算：
                  ε＝E1%λmax×分子量 / 10
吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。
若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例如，离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：
m＝C•V ，   ∵            ，      ∴      
m——溶质的量            C——溶质浓度
V——溶液体积           A——吸光度
ε——吸光系数           b——吸收池光径
∴      回收率 （100%）
      （上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等）
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。
∵    A＝ εbC      ∵    A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）
∴   A＝0.650－0.070＝0.580                ∵   b＝1cm
∴   C==7.1×10－5 mol / L            
例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9（1cm吸收池，280nm），计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。
由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法计算浓度。
∵                    ∴                 ∴    C未知＝0.01％＝0.1mg / ml
 
 

1. 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。
2. 构造：
　　能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。
　　分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。
　　一、光源
　　要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。
　　钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr为锆，Ｙ为钇）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe为铈）及ＴhＯ2
　　（Ｔh为钍）之混合物制成。汞灯发射的不是连续光谱， 能量绝大部分集中在253.6nm波长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。
　　二、分光系统（单色器）
　　单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石棱镜工作波长范围为185￣4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。 棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm，而在长波段只能达到5nm。有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。
　　三、狭缝
　　狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。
　　四、比色环
　　比争环也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
　　五、检测器系统
　　有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。
　　光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。
　　检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。

　　一、测定溶液中物质的含量
　　可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
　　含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；⑵可以避免其它物质的干扰。
　　二、用紫外光谱鉴定化合物
　　使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。

1. 原理
物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量， 相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子 、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其 特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或 测 定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸 收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。即物质在一定浓度 的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。
物质的颜色和它的电子结构有密切的关系，当辐射(光子)引起电子跃迁使分子(或离子)从基 态上升到激发态时，分子(或离子)就会在可见区或紫外呈现吸光，颜色的发生或变化是和分 子的正常电子结构的变形联系的。当分子中含有一个或更多的生色基因(即具有不饱和键的 原子基团)，辐射就会引起分子中电子能量的改变。常见的生色团有：
CO， -N=N-， -N=O，-C N，CS
如果两个生色团之间隔一个碳原子，则形成共轭基团，会使吸收带移向较长的波长处(即红 移)，且吸收带的强度显著增加。当分子中含有助色基团(有未共用电子对的基团)时，也会 产生红移效应。常见的助色基团有：-OH -NH2， -SH， -Cl, -Br, -I

2. 特点
分光光度法对于分析人员来说，可以说是最有用的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不 开紫外可见分光光度计。分光光度法的主要特点为：
(1)应用广泛
由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前 为止，几乎化学元素周期表上的所有元素(除少数放射性元素和惰性元素之外)均可采用此法 。在国际上发表的有关分析的论文总数中，光度法约占28%，我国约占所发表论文总数的33% 。
(2)灵敏度高
由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏 度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光 系数由原来的几万提高到数十万。
(3)选择性好
目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜 、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。
(4)准确度高
对于一般的分光光度法，其浓度测量的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进 行测量，则误差可减少到0.X%。
(5) 适用浓度范围广
可从常量(1%～50%)(尤其使用示差法)到痕量(10-8～10-6%)(经预富集后)。
(6) 分析成本低、操作简便、快速
由于分光光度法具有以上优点，因此目前仍广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、 制药等部门及环境监测系统。单在水质分析中的应用就很广，目前能有直接法和间接法测定 的金属和非金属元素就有70多种。

3. 应用
 3.1检定物质
根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长雖ax和摩尔吸收系数澹 是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外的药典中，已 将众多的药物紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入其中，为药物分析提供了很好的 手段。
 3.2与标准物及标准图谱对照
将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收 光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。 这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。
 3.3比较最大吸收波长吸收系数的一致性
由于紫外吸收光谱只含有2～3个较宽的吸收带，而紫外光谱主要是分子内的发色团在紫外区 产生的吸收，与分子和其它部分关系不大。具有相同发色团的不同分子结构，在较大分子中 不影响发色团的紫外吸收光谱，不同的分子结构有可能有相同的紫外吸收光谱，但它们的吸 收系数是有差别的。如果分析样品和标准样品的吸收波长相同，吸收系数也相同，则可认为 分析样品与标准样品为同一物质。
 3.4纯度检验

一、 实验名称
 邻二氮菲分光光度法测定微量铁
二、 原理
可见分光光度法测定无机离子，通常要经过两个过程，一是显色过程，二是测量过程。
为了使测定结果有较高灵敏度和准确度，必须选择合适的显色条件和测量条件，这些条件主要包括入射波长，显色剂用量，有色溶液稳定性，溶液酸度干扰的排除。
（1） 入射光波长：一般情况下，应选择被测物质的最大吸收波长的光为入射光。
（2） 显色剂用量：显色剂的合适用量可通过实验确定。
（3） 溶液酸度：选择适合的酸度，可以在不同PH缓冲溶液中加入等量的被测离子和显色剂，测其吸光度，作DA-PH曲线，由曲线上选择合适的PH范围。 
（4） 有色配合物的稳定性：有色配合物的颜色应当稳定足够的时间。
（5） 干扰的排除：当被测试液中有其他干扰组分共存时，必须争取一定的措施排除干扰。
邻二氮菲与Fe2+ 在PH2.0-9.0溶液中形成稳定橙红色配合物。配合无的ε =1.1 ×104 L• mol •cm-1 。
配合物配合比为3：1，PH在2-9（一般维持在PH5-6）之间。在还原剂存在下，颜色可保持几个月不变。Fe3+ 与邻二氮菲作用形成淡蓝色配合物稳定性教差，因此在实际应用中加入还原剂使Fe 3+还原为Fe2+ 与显色剂邻二菲作用，在加入显色剂之前，用的还原剂是盐酸羟胺。此方法选择性高Br3+ 、Ca2+ 、Hg 2+、Zn2+ 及Ag+ 等离子与邻二氮菲作用生成沉淀，干扰测定，相当于铁量40倍的Sn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+ 、Sio32-，20倍的Cr3+、Mn2+、VPO3-45倍的Co2+、Ni2+、Cu2+等离子不干扰测定。
三、 仪器与试剂
1、 仪器：721型723型分光光度计
         500ml容量瓶1个，50 ml 容量瓶7个，10 ml 移液管1支
         5ml移液管支，1 ml 移液管1支，滴定管1 支，玻璃棒1 支，烧杯2 个，吸尔球1个，  天平一台。
2﹑试剂：（1）铁标准溶液100ug•ml-1,准确称取0.43107g铁盐NH4Fe(SO4)2•12H2O置于烧杯中，加入0.5ml盐酸羟胺溶液，定量转依入500ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度充分摇匀。
       （2）铁标准溶液10ug•ml-1.用移液管移取上述铁标准溶液10ml，置于100ml容量瓶中，   并用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀。
       （3）盐酸羟胺溶液100g•L-1(用时配制)
       （4）邻二氮菲溶液 1.5g•L-1 先用少量乙醇溶液，再加蒸馏水稀释至所需浓度。
       （5）醋酸钠溶液1.0mol•L-1μ
      
四、 实验内容与操作步骤
1.准备工作
(1) 清洗容量瓶，移液官及需用的玻璃器皿。
    (2) 配制铁标溶液和其他辅助试剂。
    (3) 开机并试至工作状态，操作步骤见附录。   
    (4) 检查仪器波长的正确性和吸收他的配套性。
2. 铁标溶液的配制
 准确称取0.3417g铁盐NH4Fe(SO4)•12H2O置于烧杯中，加入10mlHCL加少量水。溶解入500ml容量瓶中加水稀释到容量瓶刻度。
   3 .绘制吸收曲线选择测量波长
取两支50ml干净容量瓶，移取100µ g   m l-1铁标准溶液2.50ml容量瓶中，然后在两个容量瓶中各加入0.5ml盐酸羟胺溶液，摇匀，放置2min后各加入1.0ml邻二氮菲溶液，2.5ml醋酸钠溶液，用蒸馏水稀释至刻度线摇匀，用2cm吸收池，试剂空白为参比，在440——540nm间，每隔10nm测量一次吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，确定最大吸收波长
    （1）
Λnm 440 450 460 470 480 490
A 0．29 0．38 0．44 0．485 0．50 0．52
Λnm 500 510 520 530 540
A 0．54 0．57 0．502 0．369 0．257
 
4.工作曲线的绘制
    取50ml的容量瓶7个,各加入100.00µɡ ml-1铁标准0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20ml，然后分别加入0.5ml邻二氮菲溶液，2.5ml醋酸钠溶液，用蒸馏水稀释至刻度线摇匀，用2cm吸收池，以试剂空白为参比溶液，在选定波长下测定并记录各溶液光度，记当格式参考下表：
编      号   1#   2#   3#   4#   5#   6#   7#
V（铁溶液）ml 0．00 0．20 0．40 0．60 0．80 1．00 1．20
   A -0.000 0.083 0.169 0.227 0.314 0.395 0.436
    
5.铁含量的测定
      取1支洁净的50ml容量瓶,加人2.5ml含铁未知试液,按步骤(6 )显色,测量吸光度
  并记录.

编     号      1#     2#     3#        
  V(未知液)ml     2.5    2.5    2.5
      A    0.425   0.425   0.421
 
K=268.1       B= -2.205        R*R=0.9945
CONC. =K *ABS+B
C = 44.55mol ml-1
6.结束工作
    测量完毕,关闭电源插头,取出吸收池, 清洗晾干后人盆保存.清理工作台,罩上一
仪器防尘罩,填写仪器使用记录.清洗容量瓶和其他所用的玻璃仪器并放回原处.

五、 附录
723型操作步骤
1、 插上插座，按后面开关开机
2、 机器自检吸光度和波长，至显示500。
3、 按AλCOTO键，输入测定波长数值按回车键。
4、 将考比溶液（空白溶液）比色皿置于R位以消除仪器配对误码率差，拉动试样架拉杆，按ABS。01键从R、S1、S2、S3，逐一消除然后再检查1~~2次看是否显示0。000否则重新开始。
5、 按T/ARAN按3键，回车，再按1键，回车。
6、 逐一输入标准溶液的浓度值，每输一个按回车，全部输完，再按回车。
7、 固定考比溶液比色皿（第一格为参比溶液）其余三格放标准试样溶液，每测一值，拉杆拉一格，按START/STOP全打印完，按回车
8、 机器会自动打印出标准曲线K、B值以及相关系R。
9、 固定参比溶液比色皿，其余三格放入待测水样，逐一测定。
10完毕后，取出比色皿，从打印机上撕下数据，清扫仪器及台面关机。
721型分光度计操作步骤
1、 开机。
2、 定波长入=700。
3、 打开盖子调零。
4、 关上盖子，调满刻度至100。
5、 参比溶液比色皿放入其中，均合100调满。
6、 第一格不动，二，三，四格换上标液（共计七个点）调换标液时先用蒸馏水清洗后，再用待测液（标液）清洗，再测其分光度（浓度）

一、实验名称
 紫外分光光度法测定蛋白质含量
二、实验原理
    1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外光：10-400 nm
可见光：400-780 nm（可被人们的眼睛所感觉）
特点：带光谱、分子光谱
应用：定性分析-最大吸收波长；
      定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）
a.定性分析原理：
  吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.
b.定量分析原理：
    根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。
    定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
c.仪器组成部件:
    各种类型的紫外-可见分光光度计，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。
                                                
   2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：
  
（1）蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
 
（2）此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。
 
（3）有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：
               蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260
    (A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)
        还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：
               蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d
 其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子
 
（4）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：
                蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225）
（A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值

三、仪器与试剂
    仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。
试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。

四、实验步骤
   1.基本操作
    （1）启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。
    （2）用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）.
    （3）在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描）
    （4）将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。
  
2.吸收曲线的制作:（找出最大吸收波长）
     将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。
   3.标准曲线的制作：
     在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。
用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278，记录如下：

浓度（mg/mL） 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
A278 0.1971 0.2532 0.3222 0.3758 0.4382

 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线
    4.样品测定：
      配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。

五、注意事项
准备工作：
（1）在测量前应把机器预热半小时。
（2）溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。
（3）由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH值的改变而改变，故进行样品测定时的PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。

测量工作：
（1）吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。
（2）.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。
（3）在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。

     一、火焰的燃烧特性
     着火极限，着火温度和燃烧速度是火焰的燃烧特性，常统称为火焰三要素。对于一个特点的燃气和助燃气混合气体，只有燃气在该混合气体中的百分含量处于某一范围内，燃烧才能开始，并扩展到个混合气体中，形成火焰。此燃气的含量的上下限称为着火极限。在着火极限内，燃烧能够自发地扩展到整个混合气体的最低温度，称为着火温度。可燃混合气体的某一点，其温度一但达到着火温度就开始燃烧，由于热传导作用，燃烧反应的混合气的这一点将传播到邻近气层，若初始反应产生的热量除了补偿由于热传导和辐射造成的损失外，还能将邻近气层的温度提高到它的着火温度，则燃烧反应持续下去，并以恒定的速度传播到整个可燃混合气。形成火焰。此传播速度就是该火焰的燃烧速度。火焰的三要素取决于可燃混合气体的性质和组成，初始压力和温度，燃烧器皿的结构和器壁的性质等众多因素。
     在实际使用中，火焰的燃烧速度是三要素中最重要的因素，它直接影响着火焰的安全使用和稳定的燃烧。火焰的燃烧速度与气体成分、最初温度、湿度和气流速度有关。要使火焰稳定而安全地燃烧，应使燃烧速度等于或小于气流速度在火焰前沿上垂直分量，用数学方程式可表示为S<V*在实际工作中，通常要求气流速度比燃烧速度大3?0倍，当气流速度V燃烧速度S时，火焰前沿的法线与燃烧器轴线的夹角*增大，火焰将被吹灭；当V<S时，S指向燃烧器内，火焰向燃烧器内传播，产生“回火”爆炸。
     气流速度取决于供气压力、燃烧器的结构和形状，对于常用缝式燃烧器，在给足的供气压力下，气流速度则取决于燃烧器的开口面积，缝宽而长，则气流速度小，反之则大。
     二﹑火焰温度
     火焰温度是火焰的主要特征之一，它对火焰中化合物的形成和离解以及待测元素原子化都起着重要作用。在火焰中，一方面可燃混合气根据其燃烧反应产生大量热能，另一方面，由于火焰中化合物的解离，以及为了将火焰中存在的平衡混合物提高到火焰温度要求消耗热量，还有火焰气体燃烧时产生的体积膨胀，也要消耗部分能量，这两方面的热能平衡决定了火焰温度。当火焰处于热平衡状态时，温度就可以用来表征火焰的真实能量。由于上述原因，在常压下，化学火焰的最高温度仅为3000℃左右。
     当吸喷试液进入火焰时，火焰要消耗大量的热量来蒸发、分解试液溶剂，以及将分解产物提高到火焰温度，从而导致火焰温度的下降。如果溶剂是水，对于低温火焰，由于火焰分解水量小，这种降温效应不明显，但对于高温火焰来说，由于分解水量大，这种降温效应则十分显著，如果采用烙醇等有机溶剂作溶剂，因为它们在火焰中也能燃烧并释放出大量热能，将它们引入低温火焰，将有助于提高火焰温度，但对于高温火焰，它们则不能明显地提高火焰温度，仍以降温效应为主，所以为了保证火焰原子化的效果，在实际工作中应注意选择合适的样品溶剂和进液量的多少。
     原子吸收光谱法所用的火焰一般都是在大气中直接燃烧的。从外界扩散至火焰中的气体发生解离也会影响到火焰温度。
     所有反应都是强烈的吸热反应，解离时要消耗燃烧反应所产生的热量，降低火焰温度。对于原子吸收光谱分析而言，只有基态原子对原子吸收分析才是有效的。这就要求火焰必须具有足够的温度，以保证试样充分蒸发和待测元素化合物解离为自由原子。从这个意义上来说火焰温度应该越高越好，但是火焰温度提高后，火焰发射强度增大，多普勒效应增强，吸收线变宽、气体膨胀因素增大，从而使之相中自由原子浓度减少，导致测定的灵敏度降低。
     此外，对于那些电离电位较低的元素，如Na、K、Rb和Cs，火焰温度高导致它们在火焰中产生严重电离，基态原子浓度降低。因此，在实际工作中，应根据试样性质和被测元素的物理特性来完成温度选择。
     三、火焰组成
     火焰的组成决定了火焰的氧化还原特性，并直接影响到待测元素化合物的分解及难解离化合物的形成，进而影响到原子化效率和自由原子火焰区中的有效寿命。影响火焰组成的因素较多，例如火焰的类型，同类火焰的燃助比，火焰的燃烧环境等。对于同一类型火焰，根据燃助比的变化可分为富燃焰、化学计量焰和贫燃焰。所谓化学计量焰是指燃助比例完全符合该燃气与助燃气的燃烧反应系数比。这种火焰温度最高，但火焰本身不具有氧化还原特性。富燃焰是指燃气大于化学计量焰的燃助比中燃气的火焰，这种火焰温度虽然略低于化学计量焰，但它由于燃气增加使得火焰中碳原子的浓度增高，使火焰中具有一定的还原性，有利于基态原子的产生；贫燃焰是指燃气小于化学计量焰燃助比中燃气的火焰，这种火焰温度较低，并具有明显的氧化性，此种火焰多用于碱金属等易电离元素的测定。
     在原子吸收光谱分析中，使用较多的是富燃焰，经研究表明，在在空气-乙炔火焰中，当乙炔含量增加时，火焰中O、OH等气体分压降低，碳原子浓度增加，整个火焰还原性增强。当碳和氧的光原子比C/O=1时，火焰组成和性质发生突变，H2O 、CO2、 O2等气体分子从火焰中完全消失，O、OH等自由基浓度降低5?个数量级，碳原子增高4数量级，火焰发亮，若再进一步增加乙炔量，固体碳粒浓度增加，火焰更亮，但还原性保持不变而火焰温度下降。
     使用有机溶剂喷入火焰，可以改变火焰的组成和特性。对于氢火焰，有机溶剂的引入只影响火焰温度，原因是氢火焰燃烧产物是水，而水火是不相容的。不过，若将有机溶剂引入烃火焰，它不仅可作为附加热源，提高火焰温度，而且更重要的是改变了火焰的组成和反应特性，根据有机溶剂内C/O比的不同，可将溶剂分为三类，C/O比大于1的是还原性溶剂，这类溶剂如C6H6、C2H5OH等，它们可以提高高火焰的C/O比，C/O比等于1的是中性溶剂如CH3OH，它的引入不会改变火焰中的C/O比，C/O比小于1的是氧化性溶剂，如HCOOH、H2O等，它们引入将降低火焰的C/O比。
     四、火焰的透射性能
     火焰的类型不同，其对不同波长的吸收能力不同，火焰本身的发射特性也不同，烃火焰在短波区具有较大的吸收，而氢火焰吸收较小，所以，对那些共振线位于短波区的元素，如As、Se、Pb、Zn、Cd等，最好采用空气-氢火焰，以减少火焰吸收的影响。空气-乙炔火焰在整个可见光区都有不同的发射信号，这些发射信号多来自火焰中激发分子的辐射谱带。氧化亚氮-空气有N分子谱带，这些发射信号使得火焰的噪声增加，测量准确性度下降。
     五、几种常见的化学火焰
     用于原子吸收光谱分析的气体混合物有：空气-氢气、氩气-氢气、空气-丙烷、空气-乙炔和氧化亚氮-乙炔等。采用氢气作燃气的火焰温度不太高（约2000℃）但这种氢火焰具有相当低的发射背景和吸收背景，适用于共振线位于紫外区域的元素（如As、Se等）分析。空气-丙烷火焰温度更低（约1900℃），干扰效应大，仅适用那些易于挥发和解离的元素，如碱金属和Cd、Cu、Pb等。实际应用最多的火焰是后两种火焰，目前为原子吸收分析所通用。
     1﹑空气-乙炔火焰
     使用空气-乙炔火焰的原子吸收光谱分析可以分析约35种元素，这种火焰的温度约为2300℃，空气-乙炔火焰燃烧稳定，重现性好，噪声低，燃烧速度不太多，有158cm/sec，但火焰温度较高，最高温度可达2500℃，作对M-O的离解能大于5ev的元素如AL（5.89）、Ti(6.9)、Zr(7.8)、Ta(8.4)等外，对大多数元素都有足够的灵敏度，调节空气、乙炔的流量比可以改变这种火焰的燃助比，使其具有不同的氧化-还原特性，这有利于不同性质的元素分析。空气-乙炔火焰使用较安全，操作较简单。这种火焰的不足之处是火焰对波长小于230nm的辐射有明显地吸收，特别是发亮的富燃焰，由于存在未燃烧的碳粒，使火焰发射和自吸收增强，噪声增大，这种火焰的另一种不足之处是温度还不够高，对于易形成难熔氧化物的元素B、Be、Y、Sc、Ti、Zr、Hf、V、Nb、Ta、W、Th、u以及稀土元素等，这种火焰原子化效率较低。
     2、氧化亚氮-乙炔焰 也就是俗称的笑气-乙炔火焰，这种火焰的温度可达2900℃，接近氧气-乙炔火焰（约3000℃）可以用来测定那些形成难熔氧化物的元素。这种火焰的燃烧速度为160cm/sec，接近空气-乙炔火焰。使用这种火焰大大地扩展了火焰原子吸收光谱分析的应用范围，约可测定70多种元素。
     氧化氩氮-乙炔火焰具有强烈的还原性，所以能减少甚至消除某些元素测定时的化学干扰。例如，采用空气-乙炔火焰测定Ca时，磷酸盐存在时产生干扰，测定Mg时，Ac产生干扰，但采用氧化亚氮-乙炔火焰测定，上述干扰全部消失，100倍以上的干扰离子不影响测定。氧化亚氮-乙炔火焰的原子化效率对燃气与助燃气流量的变化极为敏感，因此在实际工作中，应严格控制燃助比和燃烧器高度，否则，很难获得理想的分析结果。这种火焰不能直接点燃，必须先点燃普通的空气-乙炔火焰，待火焰稳定燃烧后，把火焰调节到稍富燃状态，然后迅速将空气切换成氧化亚氮，熄灭火焰时，也应先将氧化亚氮切换成空气，然后再切断乙炔供气，熄灭火焰，这一过渡过程必须严格遵守，否则该火焰极易回火爆炸。氧化亚氮-乙炔火焰在某些波段内具有强烈的自发射，使信噪比降低，该火焰的高温使许多被测元素产生电离现象，引起电离干扰。

 

1 概述
原子吸收分光光度法又称原子吸收光谱分析，是二十世纪五十年代提出，但在六十年代有较大发展的一种光学分析方法。该方法是基于测量气态原子对电磁辐射吸收而进行测定的分析方法。
原子吸收光谱的研究起源于对太阳光的观测。1802年渥拉斯通发现太阳光谱中存在许多黑线，以后弗兰霍夫详细研究了这些现象，但未阐明原因。因此，这些黑线也称弗兰霍夫线。1860年柯尔希霍夫对碱金属和碱土金属元素的发射光谱自吸现象的研究证实了基态的原子蒸气对于同种原子发射的电磁波的具有吸收作用，联系到弗兰霍夫线的位置恰好相当于某些化学元素发射的特征谱线的位置，从而说明这些黑线是由于大气层中的蒸气组分吸收了太阳辐射的某些波长的电磁波所造成的。1955年瓦尔西（Wals）正式提出原吸理论，1959年沃夫（Wolf）发明非火焰法（石墨炉），1965年威尔茨提出N2O－C2H4焰，70年代出现背景扣除技术。
原子吸收分光光度法：利用物质所产生的原子蒸气对特征谱线的吸收作用来进行定量分析的一种方法。
原子吸收分光光度法优点：
① 灵敏度高 10－10g（火焰）10－10（非）
    ② 准确性高，重现性好，<0.5%
    ③ 用途广
④ 样品量少（石墨炉5－１０ul  ０.05~30mg）
⑤ 选择性好

2原子吸收分光光度法分析基础
一、 共振吸收线
原子受外界能量激发时，外层电子可跃迁到不同能级上，我们把电子从基态跃迁到第一激发态所产生的吸收谱线称做共振吸收线。
对不同元素，其原子结构和外层电子排布不同，因此，其共振吸收线的频率也不相同。即：共振吸收线是与元素的原子结构相关的特征谱线，共振吸收能量最低，最容易发生，一般原子吸收分光光度分析就是利用元素的共振吸收来进行分析的。

二、原子吸收基本定律（以火焰法为例）
锐线光源发射的共振线被基态原子吸收的程度与火焰宽度及原子蒸气浓度的关系符合朗伯－比尔定律。
即：吸光度A=log IOV / IV = KV CL
式中：IOV－光源发出的待测元素的共振线的强度
      IV－被待测元素原子蒸气吸收后透射光的强度
      KV－原子吸收系数
      L－火焰宽度
原子吸收测试中一般固定火焰宽度，即L恒定。
所以  A= KV C    这是原子吸收的基本公式

一、 线轮廓与谱线变宽
1． 谱线轮廓
从原子吸收实验中观察到，原子对光的吸收不是绝对单色（即单一频率波长），而是有一定频率宽度。对于不同波长的光，原子蒸气吸收的程度不同，故IV随频率λ的变化而变化。吸收强度随λ或吸收系数随λ变化曲线，称谱线轮廓。
2． 谱线宽度
吸收系数等于极大值一半（1/2K0）处谱线轮廓上两点间的距离（即频率差）称吸收线的谱线宽度。
为什么吸收线会有一定宽度呢？
其一. 由于原子本身的性质决定（自然宽度）
其二. 由外因引起（如热、压力等）
3． 自然宽度ΔVN：无外界因素影响的情况下，谱线具有的宽度，这与原子发生能级间跃迁时激发态原子的寿命有关，即与原子本身性质有关，约10－5nm（根据测不准原理：激发态电子能量和跃迁时刻不可能同时测定，可推出能量测量差：ΔE•τ=h/2π                        hν= h/2πτ  =>  ΔVN =1/2πτ     τ：激发态原子平均寿命 ）
4．热变宽度（多普勒变宽）ΔVD
这是由原子在空间作无规则热运动而产生的多普勒现象引起的，
ΔVD=2V0/C（2ln2RT/M）1/2 = 7.16×10-7 V0（T/M）1/2   
ΔVD  ∝（T/M）1/2
式中：M －原子量      T －绝对温度      V0 －谱线中心频率
ΔVD  =10-３ －10-４nm
5． 压力变宽
产生原子吸收的原子与蒸气中同种原子或其它粒子之间的相互碰撞引起的能级变化，从而导致吸收光频率改变而造成的谱线频率变宽的现象。
① 劳伦斯变宽（ΔVL）：待测原子同其它粒子相碰撞而引起的谱线变宽。
ΔVL=2NAσ2Р[2/πRT（1/A+1/M）]1/2   =   Р[1/T（1/A+1/M）]1/2    约10-４－10-3nm
式中：NA －阿弗加德罗常数
      σ2 －碰撞的有效截面积
      Р－外界气体压强
      T －绝对温度
      A －相撞粒子质量    M －待测元素原子量
      R －气体常数
② 共振变宽（ΔVH，Holtzmark变宽）：同种原子间碰撞引起的谱线变宽。
ΔVL是构成压力变宽的主要因素，ΔVH只有在高浓度时才显著。因此，一般情况下，谱线宽度主要由ΔVD和ΔVL构成，其中：火焰原子化器以ΔVD为主，无火焰原子化器以ΔVL为主。
谱线变宽对测量的影响：导致原子吸收分析灵敏度下降。

3原子吸收分光光度计
原子吸收分光光度计由光源、原子化器、分光系统、检测器和显示系统构成。构造上和其它分光光度计相似。原子化器相当于其它分光光度计中的吸收池，但结构上单色器在原子化器后面。
一、 光源
作用：提供（锐线）共振线
要求：①锐线
          ②共振线
          ③强度足够，稳定性好
种类：①蒸气放电灯
          ②无极放电灯
          ③空心阴极灯：阳极－钨棒
                        阴极－待测量纯金属
工作原理见书Ｐ294－295

二、原子化系统
作用：将试样中的待测元素转变为原子蒸气
种类：火焰原子化器、无火焰原子化器、冷原子化器、氢化物原子化器
① 火焰原子化器：由雾化器和燃烧器两部分构成，是最常用原子化器。
雾化器作用：将试样雾化
燃烧器作用：使试样原子化
火焰种类：ⅰ）空气－乙炔焰<2300℃ 适用于熔点较低金属原子化
          ⅱ）氧化亚氮－乙炔焰 3000℃
          ⅲ）氧－乙炔焰>2900℃
火焰种类的选择，应根据所测元素性质决定，使之原子化但不电离。
优点：重现性好，易操作，适应范围广。
缺点：灵敏度低（仅10%左右的试液被原子化）
② 无火焰原子化器
这类原子化器和火焰原子化器依靠可燃气体燃烧产生高温提供原子化能量不同，是依靠其它能量供给方式使样品原子化的。无火焰原子化器种类很多，如石墨炉、1CP、激光、高频感应加热炉等，使用最广泛的是石墨炉，测定时分干燥、灰化、原子化三个阶段程序升温。
优点：灵敏度高（试样全部原子化），检测限低。 
缺点：干扰大，重现性差。
③ 氢化物原子化器
As、Sb、Bi、Ge、Sn、Se、Te等在酸性条件下，用强还原剂（K(Na)BH4）还原成挥发性的氢化物，这些氢化物在较低温度（<1000℃），就可分解成原子蒸气。
优点：选择性高，干扰少，灵敏度高（10－9），原子化温度低。
缺点：适用范围窄。
④ 冷原子化装置
Hg2+、 Hg+在还原剂SnCl2、盐酸羟胺作用下还原为Hg，Hg是低温元素，常温下蒸气压高，直接原子化。（10－8以上）
作用：测痕量Hg。

三、分光系统（单色器）
在原子吸收分光光度计中，空心阴极灯发射的光谱除含待测元素的共振线外，还有其它一些谱线，如待测原子的其它谱线（非共振线）、惰性气体谱线、杂质谱线、分子光谱等，这些谱线照射到检测系统上，就会影响到测定结果，因此，必须将这些谱线分开，这就要借助单色器。
单色器作用：将待测元素共振线每邻近谱线分开。
单色器构成：色散元件（光栅、棱镜）、反射镜、狭缝等组成。
S1－入射狭缝，S2－出射狭缝，Ｇ－色散元件，Ｍ－凹石反射镜（准直镜）和紫外－可见光中的连续光源不同。原子吸收所用的是锐线光源，谱线较简单。因此，不要求单色器很高的色散能力，由于激发原子数量<1%，为便于测定，要求一定的出射强度。因此，需选用适当的色散率的光栅与狭缝宽度相配合，构成适用的测定通带（带宽）。
定义：通带宽ω=D•S×10－3    式中 ω－通带宽度（nm）
                                Ｄ－色散率的倒数nm/mm
                                Ｓ－狭缝宽度（um）
S↑，IV↑，但分辨率↓，背景辐射↑，Ａ偏低，曲线弯曲，负误差。
S↓，IV↓，但分辨率↑，背景辐射↓，Ａ偏低，曲线弯曲，负误差。

一、 检测系统
     作用：光信号转变为电信号

二、 仪器分类：
1． 单道单光束
2． 单道双光束
3． 双道（多道）双光束

三、 仪器的性能
原子吸收分光光度计的种类很多，衡量仪器性能的参数主要包括：灵敏度、特征浓度、检测极限、波长精度、分辨率等。
1． 灵敏度（S） 1UPAC规定：被测元素浓度（C）或质量，改变一个单位时，吸光度（A）的变化量：即S=dA/dc  或S=dA/dm
2． 特征浓度（Sˊ）：能产生1%吸收或0.0044吸光度值时，溶液中待测元素的质量浓度（ug•ml－1/1%）
Sˊ＝C×0.0044/A       石墨炉Sˊ＝（CV×0.0044/A）Pg/1%
                                   C：被测元素含量或浓度
                                   V：进样量   P＝10－12g
3． 测限（D）：待测元素所产生的信号强度等于标准偏差三倍时，所对应的浓度或质量。即：DC＝（C/A）3σ或Dm＝（g/A）3σ
式中： C－浓度          g－待测样的量
σ－空白溶液进行10次以上测定吸光度所得到的标准偏差 
A－待测试液吸光度的平均值
4． 波长精度 λ＝λ0±πnm

4定量测试方法
原子吸收定量测试方法主要有标准曲线法，标准加入法和内标法三种。
一、标准曲线法
方法：配制一组适当的已知浓度的标准溶液(五个以上)，由低浓度到高浓度依次测定其吸光度A，作A－C曲线，即标准曲线。在同样条件下测定未知样的吸光度A未，从标准曲线上找出待测元素的浓度（或含量）。
 C1  C2  C3  C4  C3  C未
A1  A2  A3  A4  A5  A未

优点：简便、快速
缺点：基体效应（物理干扰）大，适用于组成简单的试样
注意：1、标准曲线应在线性范围
2、标准溶液应与试样用相同方法处理，使其组成尽可能一致
3、整个分析过程中工作条件始终保持一致
4、每次测定前应用标准溶液对标准曲线进行校正

二、标准加入法
当待测样品组成复杂（含量低时），标准溶液难以和试样组成一致，这时基体效应对测试影响大，往往采用标准加入法进行定量分析。
方法：等体积两份待测试样，在其中一份中加入一定量已知浓度的标准溶液，然后稀释至相同体积，并在相同操作条件下测定其吸光度，则有：
 

实际工作中很少采用计算法，而是采用4点以上作图。这种标准加入法称直线外推法。
Ax       A1           A2             A3
Cx     Cx+C0   Cx+2C0    Cx+3C0
优点：适合于组成复杂样品，可消除基体效应和某些化学干扰
不足：不能消除背景吸收的影响
注意：1、测量应在线性范围内进行
2、至少采用4点，且C 0最好与Cx相当
 C
三、内标法
方法：每个标准及待测样中分别加入已知量的内标元素，然后同时测量待测元素A1和内标元素A2，以A1 / A2的比值绘标准曲线，从此标准曲线上可求出Cx。
 C
要求：内标元素不存在试样中，原子化条件相似。
优点：可消除雾化系统和火焰等测试因素波动而产生的误差。
缺点：须用双道型仪器测量。

5干扰及其抑制
原子吸收分光光度法的干扰较发射光谱法少，但仍存在以下几方面的干扰。
一． 光谱干扰
1．与光源有关的干扰（相邻谱线干扰）
①与分析线相邻的是待测元素的谱线，这种情况下，不产生吸收，使标准曲线向下弯曲，分析灵敏度下降，负误差。若无相邻线，
则 T＝Ia/Io，若有这种相邻线，其强度为I′，
则T′＝(Ia＋I′)/(Io＋I′)
T′－T＝(Ia＋I′)/(Io＋I′)－Ia/Io＝I′(Io－Ia)/ Io (Io＋I′) > 0
∴T′> T，则A′< A    相同浓度，吸光度下降。
引起原因：常见于多谱线元素（Fe、Co、Ni等）
消除方法：减少狭缝
②相邻线不是待测元素谱线
A、不是干扰元素的吸收线，则和①效果相同，消除方法同①。
B、是干扰元素吸收线  
a.样品中不含该元素，和①效果相同，消除方法同①。
b.样品中含该元素，则使标准曲线向上弯曲，正误差
T＝Ia/Io     T′＝Ia/(Io＋I′)
T′－T＝Ia /(Io＋I′)－Ia/Io＝(－I′Ia)/ Io (Io＋I′) < 0
∴ T′< T，则A′>A
引起原因：阴极材料不纯或隋气引起，多见于多元素灯。
消除方法：选合适惰气，高纯度阴极材料。
2．光谱线重叠 正误差，假吸收
产生原因：干扰元素共振线和待测元素共振线重叠造成。
消除方法：另选分析线或分离干扰元素。
3．背景干扰（与原子化器有关的干扰）
①背景吸收：这种干扰均增加吸收值，产生正误差（包括分子吸收、光散射和火焰气体吸收三种）。
产生原因：A、火焰中成分对光的吸收称火焰气体吸收
B、某些很稳定化合物（原子化条件下不分解），如：卤化物、氧化物、氢氧化物、硫酸盐、磷酸盐等对光的吸收
C、固体颗粒的散射称光散射
消除方法：A、氘灯背景较正
B、邻近线扣除法
②背景发射：火焰本身或原子蒸气中待测元素的发射。
消除方法：调制消除，用交流电源或用斩光器使之变为交流电源。
4．连续背景发射（非锐线光源）
由灯质量引起，灵敏度降低，工作曲线弯曲。

二、 物理干扰（基体效应）
产生原因：待测试样与标准溶液在转移、蒸发等过程中的物理因素（粘度、表面张力、溶剂）等的改变的引起的干扰。
消除方法：标准加入法

三、 电离干扰
产生原因：由于电离作用导致基态原子数减少，灵敏度降低。
 
消除方法：①加入消电剂，K不变，[e]增加，故[M]增加
②降低火焰温度，K变小，[M]增加

四、 化学干扰
产生原因：待测元素和共存元素产生化学作用引起。
结果：生成难挥发化合物，使原子化率下降。
消除方法：①加入释放剂
②加入保护剂（络合）
③标准加入法
④分离

6测定条件选择
测定条件对测定灵敏度、准确性及干扰情况有决定性影响。主要测试条件有：
1．分析线选择：共振或次灵敏线
2．灯电离的选择
灯电流小，灵敏度高，但I过小则测量精确度差。
灯电流大，谱线宽度变大，灵敏度下降，灯寿命缩短。
实际工作中由A－i曲线选择 
3．狭缝宽度
狭缝宽度变（过）大，稳定性下降，背景干扰上升。
以能排除光谱干扰和具有一定的透光强度为原则
4．原子化条件选择（火焰法）
①火焰类型：易电离→低温焰，难电离→高温焰
②燃烧器高度：外焰：氧化性，易电离   内焰：还原焰，背景吸收↑，中间层：中性焰，原子蒸气多，较好。
  ③助燃气和燃烧气比例：控制温度。

① 该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。
热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。
② 使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。
③ 在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
④ 将仪器电源开通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的单交波长，灵敏度选择请参照“5”调节“0”电位器使用电表指“0”；然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度附近，仪器预热20分钟。
⑤ 放大器灵敏度有五档，是逐步增加的，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后需按“4”重新校正“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
⑥ 预热后，按“4”连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
⑦ 如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，当指针稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。
⑧.仪器分析结束后，并关掉电源开关。

（一）仪器基本操作
1．连接仪器电源线，确保仪器供电电源有良好的接地性能。
2．接通电源，使仪器预热20分钟。（不包括仪器自检时间）
3．用<MODE>键设置测试方式：透射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式，
4．用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。
5．将您的参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不应有气泡，悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。
6．将%T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“％T”键，此时显示器显示“000.0”
7．将参比样品推（拉）入光路中，按“0A／100%T”键调0A／100%T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“100.0”％T或“0.000”A为止。
8．当仪器显示器显示出“100.0”%T或“0.000”A后，将被测样品推（拉）入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的透射比或吸光度值。
（二）样品浓度的测量方法
1．已知标准样品浓度值的测量方法
   （1）用＜MODE＞键将测试方式设置至A（吸光度）状态
   （2）用波长设置样品的分析波长，根据分析规程，每当分析波长改变时，必须重新调整0A/100％和0％T。
   （3）将参比样品溶液，标准样品溶液和被测样品分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不应有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。
   （4）将参比样品推（拉）入光路中，按“0A／100%T”键调0A／100%T，此时显示器显示的“BLA”直至显示 “0.000”A为止。
   （5）用<MODE>键将测试方式设置至C状态。
   （6）将标准样品推（或拉）入光路中。
   （7）按“INC”或“DEC”键将己知的标准样品浓度值输入仪器，当显示器显示样品浓度值时，按“ENT”键。浓度值只能输入整数值，设定范围为0-l999
   （8）将被测样品依次推（或拉）入光路，这时，您便可从显分别得到被测样品的浓度值。
2．已知标准样品浓度斜率（K值）的测量方法
（1）用<MODE>键将测试方式设置至A（吸光度）状态。
（2）用波长旋钮设置样品的分析波长，根据分析规程，每当分析波长改变时，必须重新调整0A/100％和0％T。
（3）将您的参比样品溶液和被测样品分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不应有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。
（4）将参比样品推（拉）入光路中，按“0A／100%T”键调0A／100%T，此时显示器显示的“BLA”, 直至显示 “0.000”A为止。
（5）用<MODE>键将测试方式设置至F状态。
（6）按“INC”或“DEC”键输入己知的标准样品斜率值，当显示器显示标准样品斜率时，按“ENT”键。这时，测试方式指示灯自动指向“C”，斜率只能输入整数。
（7）将被测样品依次推（或拉）入光路，这时，您便可从显示器上分别得到被测样品的浓度值
（三）使用注意事项   
1．仪器应放置在室温在5-35℃，相对湿度不大于85％的环境中工作。
2．放置仪器的工作台应平坦，牢固，不应有振动或其他影响仪器正常工作的现象。
3．强烈电磁场，静电及其他电磁干扰，都可能影响仪器正常工作，放置仪器时应尽可能远离干扰源。       
4．仪器放置应避开有化学腐蚀气体的地方，如硫化氢、二氧化硫，氨气等。
5．仪器应避免阳光直射。
6．仪器使用在额定电压的±10％范围内，频率变化在±1Hz范围内，并要有良好的接地。
7．仪器通电前检查
（1）接通电源，让仪器预热至少二十分钟，使仪器进入热稳定工作状态。有时仪器会因运输、存储环境因素而受潮产生诸如读数波动等不稳定现象，此时，请保持仪器周围有良好的通风环境，并连续开机数小时，直到读数稳定为止。
（2）仪器接通电源后，即进入自检状态，首先显示“UNICO”，数秒后显示为：
0.×××A（或-0.×××A），即自检完毕。
8．维护
（1）每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，经常擦拭样品室，以防废液对部件或光路系统的腐蚀。

     ① 打开仪器开关，使仪器预热并自检20min。自检结束后波长自动停在546cm处，测量方式自动设在透射比方式上（%T），并自动调为100%和0%T。
      ②.按“方式键”，将测试方式设置为透射比方式，并显示“XXXrm XXX.X%T”。
      ③.按“△”、“▽”波长设定键，设置到所需要的工作波长。
      ④.将参比溶液和被测溶液分别到入比色皿中。比色皿内的溶液面不应低于25mm，大约25ml，被测样品中不能有气泡或漂浮物。
      ⑤.打开样品盖，将参比溶液放到样品架的第一个槽中，被检测样品放到其他槽中。被测样品波长在340rm¬——1000rm范围内，使用玻璃比色皿；被测样品波长在190rm——340rm范围内，使用石英比色皿。比色皿的透光部分表面不能留有指印、溶液痕迹。
      ⑥.将“参比溶液”推进光路中，按“100%T”键调整零ABS。
      ⑦.将被测溶液推或拉入光路中，此时显示器所显示的是被测样品的吸光度参数。
      ⑧.仪器分析结束后，并关掉电源开关。

1． 启动UV—2100紫外可见分光光度计应用程序，软件将自动进入到自检画面。
2． 软件启动后，在菜单中点“设置—仪器”，可设置仪器的换灯点，除特殊测量外建议不要更改，使用最佳的换灯波长340nm作为换灯点。如果长期不使用氘灯和钨灯，可以在自检后点击“氘灯”和“钨灯”键以关闭两灯电源，延长灯的使用寿命，但在关闭后重新开启，需要再预热一段时间，才能使仪器达到最佳的测量效果。重新选择狭缝，需要重新自检。
3． 在菜单中点“设置—显示范围”，可以设置谱图上面横轴和纵轴的范围，使之更适合观察所需的范围内的谱图。在菜单中点“设置—自动调节”，将自动设置最合适的范围，以使所有数据都能合适的显示在图形上。
（一）光谱扫描测量方式
4． 点击工具栏上的功能“光谱”项，进入光谱扫描测量后，首先点击“参数”项，进入参数选择页面，设置好光度范围、取样间隔、能量选择的参数
5． 将参比池和样品池都加入参比溶液，盖好样品室盖。按下显示窗“Baseline”命令按钮，仪器将自动进行基线校正，此项工作只需在第一次测量时进行，只要不改变参比溶液和测量波长范围的情况下，只需校准一次。
6． 在样品池中加入样品液，单击“测量“命令按钮，就可进行测量运行了，当进行样品扫描测量时，显示器上将会动态显示实时图谱，当前拨岔路能够位置及对应的测量数据。在测量中途，若用户想中断实时测量，可单击”停止“按钮，便可中断测量，测量结束后，一切动态显示将停止。
7． 测量完成后，点击工具栏上的“标尺”，显示一垂直滚动条可观察数据。点击测量图谱右侧的“样品数据”也可以观察数据。单击“保存”按钮可储存当前图谱。单击“打印”按钮，便可通过打印机打印当前的扫描图谱。
（二）定波长测量方式
8． 单击工具栏“光度”上菜单栏，进入定波长测量方式。
9． 进行测量方式、波长个数、输入波长值和平均次数等参数设置。
10． 在测量前，必须进行校准，设置好参数后，在参比池和样品池中加入参比溶液，盖好样品室盖；按下“Autozero”按钮，仪器自动进行校准，此项工作只需在第一次测量时进行，只要不改变参比溶液和测量波长范围的情况下，只需校准一次；在样品池中加入样品液，单击”测量“命令按钮，则进行测量操作
（三）时间测量方式
11． 单击工具栏上“时间“测量功能。
12． 点击菜单中的“设置—参数“，在此选择测量方式、吸光度（ABS）、透过率（T%），输入显示光度范围、测量时间、测量波长和取样间隔。
13． 在测量前，必须进行校准。设置好参数后，在参比池和样品池中加入参比溶液，盖好样品室盖，按下Autozero”按钮，仪器自动进行校准，此项工作只需在第一次测量时运行，只要不改变参比溶液和测量波长的情况下，只需校准一次，在样品池中加入样品液，单击“测量”命令按钮，则进行测量操作。
（四）定量测量
14． 单击主菜单下“定量”菜单栏。定量测量有多种测量方式：单波长标准系数法、双波长等吸收点法、双波长系数倍率法、三波长法。
<1> 单波长标准系数法
15． 进入定量测量方式后，点击“参数”按钮，进入参数选择对话框。
A 浓度法
16． 在定量测量参数设置对话框中，输入测量波长值，选择拟合方式，选择是否要将零点作为拟合的有效值，输入标样浓度个数，同时在浓度标样中输入对应的浓度值。设置完毕后，按下“确定”按钮，进入测量界面。
17． 先在参比池和样品池中放入参比液进行校零，按下“AutoZero”按钮，仪器将自动进行校准。
18． 按下“Standard”按钮，此键将变成“Unknown”，同时进入浓度标样的测量界面，此时依照参数设置的标样值，在样品池中加入对应的浓度标样，按下“测量”，出现输入标样号对话框，输入此时浓度标样对应的标样号，确定后仪器开始测量，依次测量完所有的标样后，标准曲线也同时自动生成。
19． 用标样建立好曲线后，按下“Unknown”按钮，此键将变成”Standard”，同时进入测量界面，在样品池中放入待测样品，按下“测量”按钮，仪器开始测量。
注意：
1． 开、关机时，应该遵守开、关机原则。即开机时先开主机电源，等大约十秒钟氘灯点燃后开计算机电源。关机时，先关计算机电源（关机前退出应用程序）。
2． 不允许使用酒精、乙醚、汽油等有机溶液擦洗仪器。
3． 久放置不用时，应定期通电驱潮。

一、准备工作：
  1、开启稳压电源
  2、开启紫外分光光度计电源
  3、开启计算机系统电源
  4、单击桌面上“UV Solution 1.2”图标
  5、单击画面右侧的“Method”，设置参数
(1) 单击General选Wavelength Scan
(2)单击Instrument 选Abs
       Sdart: （      ）
       End;  （      ）
       Scan Speed: 600nm/min
       Light Source  选 D2
                        W1
       Lamp Change （       ）
       Slit （      ）
       PMT mode 选 Auto
   （3）单击Monitor
         max :（      ）
         min :（      ）
(4) 单击Report, 前4个方框均选中，即“√”，单击“确定”钮
二、样品测定：
   1、放参比（在两个样池架上都放参比），单击右侧“Baseline”，在Baseline框里选System,击“OK”开始扫描。待黄色“Scanning”变为绿色“Ready”时说明扫描基线完成。
   2、放样品（去掉前边的参比放样品，后边的不动），单击“Measure”开始测样扫描。待黄色的“Scanning”变为绿色“Ready”时说明样品扫描完毕。
   3、最小化
   4、单击右侧“Property”出现“Spectrum Properties”画面，
（1）单击其中的“Axes”，填上X轴和Y轴的各项。
（2）单击其中的“Report”，前4个方框均选中即“√”，单击“确定”钮。
   5、保存数据：
（1）保存图谱，单击File→Save as,文件类型“*∙udp”，确定好文件名，单击“保存”按钮。
    （2）单击File→Save as,文件类型“*∙txt”，确定好文件名，单击“保存”按钮。
三、关机：先关工作站→紫外分光光度计电源→计算机→稳压电源。
四、注意事项：
   1、不要随便挪动仪器及仪器的各连接线。
   2、一定要严格按照操作规程中的各项要求进行操作。
   3、扫基线前要同时放两个参比（即在两个样池架各放一个）。

 Mini-1240型紫外可见分光光度计使用操作规程
操作程序：
（一）打开样品室盖，检查光路是否通畅（如样品室内放置有硅胶袋，请拿出）
（二）接通主机电源，预热30分钟。开机仪器即进行自检，自检时间约需7分钟
（三）仪器自检完毕自动进入初始菜单
在初始菜单出现后，如果出现如下对话框

则可按“RETURN”键或“ENTER”键回到初始菜单，然后按“2”键进入光谱测定（Spectrum)模式，按“F1（BaseCorr)”键进行基线校正
（四）测定参数设置
1、仪器基本操作参数的设置
    在初始菜单界面下，按数字键“5”进入“Utilities”模式，进行A值或T值小数位数、光源、数据积分时间等的设置或改变。
设置光源时，如果是可见光区的测定，则选择“WI lamp only”(碘钨灯)；如果是紫外光区的测定，则选“D2  lamp only”(氘灯)，但在关机前须把光源调至“WI lamp only”。在任何测量中都不要选择“Automatic switching”。（用▲、▼移动光标， “ENTER”键确认）
2、测定模式的选择
在初始菜单界面下，按数字键1~4选择相应的测试模式进行分析测试。以下的操作以Quantitation（定量测定）为例进行说明。按数字键3进入定量测定模式菜单
3、定量测定参数的设置
在定量测定模式菜单下有5个选项(按数字键1~5进入各选项设置参数)
1）Meas 测定方法（以1λ 为例）
    在定量测定模式菜单下按1键，出现以下三个选项
            1、1λ  (单波长测定方法）常用方法  
               2.   2 λ (双波长测定方法）
               3.   3 λ (三波长测定方法）
            按1键，按提示输入波长值，按ENTER确认
2）Method:  (三种定量方法）
在定量测定模式菜单下按2 键，出现 Calibration method （建立方程的方法）
         1. K-factor (C=K*ABS+B) （常数因子模式）
         2. 1 point calib. （一点曲线）
         3. Multi-point calib. (多点曲线。常用，以此为例说明)
    按3键，则  
            No. of Std. (标准样的个数） = 6（1~10，按实际情况键入数字，按ENTER确认）
            Order  = 1 (1~3)  （标准曲线方程的次数，只有多点曲线模式可选择）
            0 intercept :  NO  or  YES (曲线过原点，对于多点曲线，应选择NO)
3.  No. of Meas. : (测定次数，即同一样品，测定时读数的次数，多点曲线方法只能选1）
4.  Unit:(浓度单位，有10种选择，可根据需要自行选择）
5.  Data print  : 数据打印。NO  or YES
 
     参数设置完毕，在定量测定菜单界面的下方提示Press START key for calibration routine. 此时，如果之前没有对样品室进行参数的设置和样品室的初始化，则需按F2，进入SmplCmpt (Sample Compartment Control)，对样品室的控制设置参数并进行样品室的初始化，便可进行下一步的操作。
样品室控制参数设置、初始化完成后，按“RETURN”返回定量测定菜单界面，将标准样品倒入已经过配对测试的吸收池（比色皿）中，然后依浓度高低按从低到高的顺序将吸收池放入吸收池架，按“AUTO ZERO”键以浓度为0的标准溶液调节零点，之后按START进入曲线绘制程序
① 首先，按界面显示依次输入标准曲线系列浓度值，输入完毕提示如下
Get ABS value by ?(如何获得A值？）              
1) Key-in         2) Meas. (only cell 1)                   
键盘输入         测定（一点曲线模式）         
3) Multi-cell sequential meas.（多池连续测定）
②然后按实际需要选择获得A值的方式，即按对应的数字键，之后依提示进行下一步的操作
如按“3”键则依提示按STASRT/STOP键开始连续测定

标准曲线测定完毕，在测定结果显示界面下，
   1）按F1（ClbCurve）将可看到曲线，在曲线界面还可查看曲线方程和r2(F4)及其他操作
   2）按F2可进行标准曲线的更改（依提示操作）
   3）按F3进入样品测试菜单。
     进入样品测试菜单，把待测样品倒入比色皿（吸收池），然后将比色皿插入吸收池架，盖上样品室盖，按START/STOP开始样品测定，测定完毕，记录数据（如连接打印机则可将数据打印输出）。测试完毕，按RETURN（返回键）键直到回到初始菜单，方可关机。在返回过程中，会有提示 “删除数据？”，此时用    、  移动光标至OK，按ENTER确认，将数据删除，建议不要将数据存贮于仪器内。
注意事项:
1、在机身左侧有一通风散热风扇，请不要在风扇前放置物品，以免妨碍通风散热。
2、当使用有机溶剂时，必须保证通风
3、开机前须先检查样品室内是否有物品挡住光路，如有物品挡在光路上，会影响仪器的自检，严重的还会引起仪器故障。
4、须保持机壳及样品室的清洁，可用湿润的软布蘸水或温和的洗洁剂擦拭，避免用过湿的布擦拭机壳及样品室或使溶液滴至样品室。

1. 开机，打开电源，按F1键，选择元素灯；
2. 设定波长、电流等参数，完成设置后按OK键；
3. 按F3键，设置标准溶液浓度；
4. 调整光斑位置、狭缝大小，注满水；
5. 打开空气，打开乙炔，检查漏气；
6. 点火，调零，火焰调为蓝色；
7. 按F4键，用（AZ）键调零，测定样品；
8. 用COPY键进行屏幕打印；
9. 先关乙炔，再关空气，关电源。

一、 准备工作：
１、 开启稳压电源，待稳定到220V后即可进行下一步。
２、 开启荧光分光光度计电源（按钮在仪器前面）。
３、 开灯（有氙灯和钨灯），如用氙灯，就将开关扳到氙灯位置，按氙灯按钮。
４、 开启计算机系统电源。
５、 从桌面上双击“WGY—10型荧光分光光度计”图标，
系统依次进行 激发光栅初始化
             激发狭缝初始化
             激发滤光片初始化
             发射光栅初始化
             发射狭缝初始化
             发射滤光片初始化
      初始化结束。
二、进入工作状态
1、扫描激发谱
（1）选激发单色器
  范围：起始波长：（     ）
        终止波长：（     ）
  最大值：（     ）
  狭缝宽度：（     ）
  负高压：（     ）
（2）单击“激发”钮，定起始波长（     ），击“确定”。
（3）单击“发射”钮，输固定波长（大于激发波长最大值）。
（4）放样品
（5）单击“单程”扫描钮
  2、扫描发射谱
   （1）选发射单色器
       范围：起始波长 （     ）
             终止波长 （     ）
           最大值：（     ）
           狭缝宽度：（     ）
           负高压：（     ）
（2）单击“发射”钮，定起始波长，击“确定”。
   （3）单击“激发”钮，输入激发谱中得到的最大激发波长，击“确定”。
   （4）改变寄存器
（5）单击“单程”扫描钮。
  3、保存数据：扫描完后保存数据。
三、关机：先关掉工作站→灯（氙灯或钨灯）→荧光分光光度计→计算机→稳压电源
四、注意事项：
  1、一定要严格按照上述操作规程进行操作。
  2、不要随便挪动仪器和仪器后边的连接线。
  3、保持室内清洁，实验完毕后要将桌面、地面打扫干净后才能离开实验室。
  4、在实验室内和离开实验室时不要大声喧哗。