离心技术是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中,利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。 一、基本原理 1、重力场中的沉降 将含有微粒的悬浮液静置一段时间,液体中的微粒受重力作用,使得较重的微粒下沉与液体分开,即为”重力沉降”。微粒在介质中的沉降受到介质的浮力、介质阻力和扩散现象的影响。 2、相对离心力 离心技术是根据微小颗粒在离心力场中的行为建立并发展起来的。离心机转子能够以稳定的角速度作圆周运动,从而产生一个强大的辐射向外的离心力场,它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度。使之受到一个向外的离心力。离心机所产生的离心力场 G,可由下公式计算 3、沉降速度 沉降速度是指在强大的离心力作用下,单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。 4、沉降系数 沉降系数是指在单位离心力场作用下,颗粒沉降的速度以S表示:S=v/ω2r 名称 沉降系数,S 相对离心力,g 离心转速,r/min |
二、离心机的构造 离心机可按额定的最高转速大小分类:低速离心机,<10×103rpm; (一)离心室 离心室是转子在真空、低温下进行高速运转的场所。由内外两层钢筒构成。内层一般为防腐的不锈钢制作,外层多为10mm的钢板制成。中间设有制冷的蒸发器。筒上装有钢盖,只要离心机处于运转状态就自动锁死。 (二)驱动系统 主要由电机和转轴组成。老型号多采用变速齿轮箱,利用齿轮轴,同时为防止齿轮摩擦还要配备润滑系统。而新型号则采用变频电机直接驱动转子,结构简单且效率提高。 (三)冷冻系统 利用冰箱压缩机进行制冷。近年来也较多的采用了半导体制冷方式。 (四)真空系统 为了减少空气与转子的摩擦和避免旋转涡流的产生,保持转子平稳运转和温度控制而设置了真空系统。主要由机械油泵及扩散泵。 (五)操作系统 这是全机的中枢控制系统 三、离心转子和离心管(杯) 离心转子是高速和超速离心机的主要部件。由于高速运转而产生强大的离心力场,因此选用高强度的合金(铝合金、钛合金、超硬铅和锻铝)来制造。制造程序严格,使用前要进行一系列试验(超速试验、满速爆炸试验和寿命试验等),确保使用安全。 (一)角(度)转子 各种离心机的基本转子和最高速转子。角转子中离心管中心与旋转轴夹角一般为15——40°,呈圆锥形。常采用铝或钛合金制造。 (二)甩平(水平)转子 离心管放于装在转轴上的吊篮中。静止时离心管与中心线平行,高速运转时与中心线垂直,此时离心管与离心力方向一致,样品具有最长的沉降距离。同时减少了由于对流和旋涡引起的壁效应,提高分离效果。 (三)垂直转子 是角度转子的垂直放置。此种转子中样品沉降距离特别短,对流不明显,离心时间短。比较适合等密度区带离心。 (四)区带转子 主要由一个转子桶和可移动的顶盖组成。桶中心位于转子的旋转轴上,转子桶中装有叶片状(或隔板)装置,把转子内部分成四个或多个扇形小室。叶片上有导管,梯度液或样品液从转子中央液管泵入,通过这些导管分布到转子四周。转子内的叶片可防止样品或梯度液受突然变速时产生涡流,有改善分离效果的作用。 (五)连续流动转子 此类转子一般装在低速或高速离心机上做大量培养液或原液的浓缩和分离。 (六)其他转子 除上述转子外还有供分析用的超离心机的分析转子;用于血细胞、肝及其组织细胞、淋巴细胞、酵母及其他单细胞的连续分离的细胞清洗转子;土壤脱水转子等。 |
(七)离心转子的常用标记和转子参数 1、转子标记的意义 2、转子参数 (八)离心管 不同材料的离心管耐酸、碱、抗腐蚀、抗温变形性能不同,能承受的压力也不同。必须依据样品溶剂的化学性质和离心转速选择合适的离心管。 PE CAB PC PP PE CAB PC PP 四、各种离心机的性能及适用范围 常见的离心机包括:超速离心机(制备和分析)、高速冷冻离心机、大容量冷冻离心机、连续离心机、一般用途的低速离心机(无冷冻)及台式(超速、高速、低速、特殊用途)离心机等。 离心机类型及应用范围 |
(一)低速离心机 低速离心机额定转速一般为4000rpm,且连续可调,相对离心力最大可达5000g—6000g。根据处理样品容量的大小可分为:锥型台式低速离心机和方型台式电动离心机。此类离心机体积小,重量轻,容量较大,且能自动控制工作时间,操作简单,使用方便。适用于医院化验室、生化及分子生物学试验室进行定性分析;血浆、血清、尿素、疫苗制造等。另外,还有水平桶式、大容量、带冷冻的、落地式等供分离和制备使用。 (二)高速离心机 (三)超速离心机 五、离心方法 制备离心方法和分析离心方法。根据待分离物质理化性质的不同,制备性离心可采用差速沉淀离心、速度区带离心和密度离心等。要获得较满意的分离效果,必须选择合适的离心转子。 离心转子的选择 (一)差速沉淀离心 分别改变离心速度用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀的方法。它比较适用于沉降速度差别在一到几个数量级的混合样品的分离,对于差别较小的物质难以得到满意效果。 (二)速度区带离心 将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降。样品的颗粒按照其不同的沉降速率沉降,从而互相分离。离心一定时间后不同大小的颗粒将沉降于不同的层次,产生所谓“区带”。由于是根据颗粒的沉降速率来完成分离,且离心过程中形成区带,所以称作:速度区带离心。这种方法适用于分离密度相似而大小有别的样品。 |
1、 介质梯度密度的特征和制备 介质梯度密度主要用来克服对流和r增加的影响。介质的密度沿半径方向逐渐增加,梯度的最大密度小于样品混合液的最小密度。装好梯度液后,将样品铺在梯度液的顶部,即可离心。 密度梯度溶液可手工制备、仪器制备或冷冻法制备: 材料名称 相对分子量 可制备最大密度 用途 (1) 蔗糖溶液:速度区带离心中形成密度梯度最常用的溶质。不同浓度(重量%)的蔗糖溶液具有不同的密度和粘度,随温度生高,密度和粘度都会降低。利用蔗糖密度梯度溶液分离样品,不仅取决于蔗糖浓度而且要考虑样品密度。适中的蔗糖溶液(<40%)可用于蛋白质和核酸的速度区带分级分离。冈崎片段就是利用此方法发现的。 3、区带转子中的离心 区带转子主要用于从大量样品中对大分子或颗粒进行蔗糖密度梯度的速度区带离心,主要是制备性的分离与纯化。其操作步骤为4步: |
(三)等密度离心 又称平衡离心。样品被置于一个较陡峭的密度梯度中沉降。该梯度的最大密度高于样品混合液的最大密度,梯度的最小密度低于样品混合液的最小密度,当样品颗粒沿梯度运动到与颗粒的浮力密度相同的密度层时,就停止了运动,经过一段较长时间的离心,样品中所有不同密度的颗粒都将停止在各自的等密度区域。即为根据颗粒各自不同的浮力密度而进行分级分离。此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。 1、? 介质密度梯度的特征和制备 2、等密度离心介质的选择 (五)离心操作要领 1、精确地平衡离心管和它们的内容物是十分重要的。超速离心机转子是镶置在一根很细的轴上,因此在两只离心管平衡时,重量之差不得超过各种离心机说明书上所规定的范围。制备性超速离心机两离心管重量之差不得超过0.1g。有套筒的离心管应带套筒一起平衡。离心管套筒严禁在不同离心机之间混用(特别是不同型号离心机)。 |
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