生命经纬知识库 >>所属分类 >> 生物化学技术   

离心的技术

标签: 离心技术

顶[0] 发表评论(54) 编辑词条

离心技术是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中,利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。

一、基本原理

1、重力场中的沉降

将含有微粒的悬浮液静置一段时间,液体中的微粒受重力作用,使得较重的微粒下沉与液体分开,即为”重力沉降”。微粒在介质中的沉降受到介质的浮力、介质阻力和扩散现象的影响。

2、相对离心力

离心技术是根据微小颗粒在离心力场中的行为建立并发展起来的。离心机转子能够以稳定的角速度作圆周运动,从而产生一个强大的辐射向外的离心力场,它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度。使之受到一个向外的离心力。离心机所产生的离心力场 G,可由下公式计算
G=ω2r ω—转子的角速度 r—旋转半径(物质质点所处位置与旋转中心的距离)
离心力场常用相对离心力RCF(Relative Centrifugal Force,RCF)来表示。相对离心力的大小用相当于地心引力(重力加速度,g)的倍数来表示,即:
RCF=ω2r/g×g=(2πn)2r/602g×g=1.119×10-5×n2r×g
N—转子转速,rpm/min g—重力加速度,980.6cm/s2

3、沉降速度

沉降速度是指在强大的离心力作用下,单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。
被分离物质颗粒(或大分子)在离心管中与转子一同旋转时承受着沿半径方向的直接离心力Fc作用。 Fc=Mω2r, M—被分离物质颗粒的质量。
其沉降速度v为;v=6.092×10-4×D2(ρ-ρm)n2r/ηm
D—颗粒直径,cm;ρ和ρm分别为颗粒和介质的密度,g/cm3;ηm—介质粘度,单位帕•秒Pa•s
由此看出,颗粒沉降速度与三个方面因素有关:
a、颗粒本身性质:沉降速度与颗粒直径和密度成正比。密度相同时大颗粒比小颗粒沉降快;大小相同时,密度大的比密度小的沉降快。
b、介质性质:沉降速度与介质粘度、密度成反比,介质粘度、密度大则颗粒沉降慢。
c、离心条件;颗粒沉降速度与离心时转速和旋转半径成正比。如其它条件不变,沉降速度随着r的增大而增大,在进行速度区带离心时,r对沉降速度的这种影响不利于达到满意的分离效果,所以需要在沿半径方向上相应的增加介质的密度和粘度以克服r的增加造成的影响。

4、沉降系数

沉降系数是指在单位离心力场作用下,颗粒沉降的速度以S表示:S=v/ω2r
细胞及细胞的各种组成成分的沉降系数有很大的差异,我们可用生物样品的沉降系数的差异采用离心技术将它们彼此分离开来。
细胞及细胞内某些沉降系数范围和离心条件

名称 沉降系数,S 相对离心力,g 离心转速,r/min
细胞 >107 <200 <1500
细胞核 4×106—107 600——800 3000
线粒体 2×104—7×104 7000 7000
微粒体 102—1.5×104 1×105 30000
DNA 102 2×105 40000
RNA 4—50 4×105 60000
蛋白质 2—25 >4×105 >60000

二、离心机的构造

离心机可按额定的最高转速大小分类:低速离心机,<10×103rpm;
高速离心机,10×103—25×103rpm;和超速离心机,>30×103rpm。一般常用的台式离心机转速为4000rpm。其主要部件为:电机和转轴。随转速增加会加设冷冻和真空设备。

(一)离心室

离心室是转子在真空、低温下进行高速运转的场所。由内外两层钢筒构成。内层一般为防腐的不锈钢制作,外层多为10mm的钢板制成。中间设有制冷的蒸发器。筒上装有钢盖,只要离心机处于运转状态就自动锁死。

(二)驱动系统

主要由电机和转轴组成。老型号多采用变速齿轮箱,利用齿轮轴,同时为防止齿轮摩擦还要配备润滑系统。而新型号则采用变频电机直接驱动转子,结构简单且效率提高。

(三)冷冻系统

利用冰箱压缩机进行制冷。近年来也较多的采用了半导体制冷方式。

(四)真空系统

为了减少空气与转子的摩擦和避免旋转涡流的产生,保持转子平稳运转和温度控制而设置了真空系统。主要由机械油泵及扩散泵。

(五)操作系统

这是全机的中枢控制系统

三、离心转子和离心管(杯)

离心转子是高速和超速离心机的主要部件。由于高速运转而产生强大的离心力场,因此选用高强度的合金(铝合金、钛合金、超硬铅和锻铝)来制造。制造程序严格,使用前要进行一系列试验(超速试验、满速爆炸试验和寿命试验等),确保使用安全。

(一)角(度)转子

各种离心机的基本转子和最高速转子。角转子中离心管中心与旋转轴夹角一般为15——40°,呈圆锥形。常采用铝或钛合金制造。
优点:强度高、重心低、运转平稳、离心时间短、寿命长和使用方便等。
缺点:具有壁效应(离心管外壁部分形成的强烈的对流和旋涡)影响分离纯度。
此转子常用于速度沉淀制备离心和样品浓缩。角转子的规格较多,常用32×15ml;6×50ml。

(二)甩平(水平)转子

离心管放于装在转轴上的吊篮中。静止时离心管与中心线平行,高速运转时与中心线垂直,此时离心管与离心力方向一致,样品具有最长的沉降距离。同时减少了由于对流和旋涡引起的壁效应,提高分离效果。
此种转子最适合蔗糖速度区带离心,具有很高的分辨率。此类转子主要有4吊和6吊等,由于强度较低,重心偏高,所以特别注意离心管的总质量差不能超过允许范围。且它容量较小,离心时间较长,主要用于速度区带离心进行分离。

(三)垂直转子

是角度转子的垂直放置。此种转子中样品沉降距离特别短,对流不明显,离心时间短。比较适合等密度区带离心。
使用垂直转子有一个使液面从新转向分布的过程称为“再定向”。它适合氯化铯等密度离心和蔗糖速度区带离心。

(四)区带转子

主要由一个转子桶和可移动的顶盖组成。桶中心位于转子的旋转轴上,转子桶中装有叶片状(或隔板)装置,把转子内部分成四个或多个扇形小室。叶片上有导管,梯度液或样品液从转子中央液管泵入,通过这些导管分布到转子四周。转子内的叶片可防止样品或梯度液受突然变速时产生涡流,有改善分离效果的作用。
区带转子具有“壁效应”极小而分离效果好。转速高、容量大回收梯度容易和不影响分辨率等优点。但由于样品和介质直接接触转子,耐腐蚀要求较高,操作较复杂,一般要求专业人员操作。
用于高速的转子常用铝合金制造,转速可达10000rpm,容量可达1000ml。用于超高速常用钛合金制造,转速可达60000rpm,容量可达1500ml以上。

(五)连续流动转子

此类转子一般装在低速或高速离心机上做大量培养液或原液的浓缩和分离。
优点:样品连续操作、转子体积小、转速较高、分离效果好、操作简单等。

(六)其他转子

除上述转子外还有供分析用的超离心机的分析转子;用于血细胞、肝及其组织细胞、淋巴细胞、酵母及其他单细胞的连续分离的细胞清洗转子;土壤脱水转子等。

(七)离心转子的常用标记和转子参数

1、转子标记的意义
(1)符号:FA——角转子;V——垂直转子;SW——甩平转子;CF——连续转子;Z——区带转子
(2)英文字母后的数字表示该转子的最大额定转速。
(3)Ti——表示由钛或钛合金为材料制成,不标明的表示为铝或铝合金制成。如:SW65Ti为甩平转子,最大转速65000rpm,钛金属制成。

2、转子参数
Rmax:从转轴中心至离心管外沿或离心管底部的距离。
Rmin: 从转轴中心至离心管内沿或离心管顶部的距离。
RPMmax:转子的最高安全转速。
FRCmax:转子在RPMmax运转时,在Rmax处的相对离心力。
FRCmin:转子在RPMmin运转时,在Rmin处的相对离心力。
K:衡量转子相对效率的量,K值愈小效率愈高,所需离心时间愈短。
K=┮Rmax/Rmin 3600ω2×1012=2.53×1011×┮Rmax/Rmin RPM2max
各种转子在使用一定年限或运转一定转数后,其转子的密度会发生变化而使强度降低。因此,必须降速使用。具体情况遵循使用说明。

(八)离心管

不同材料的离心管耐酸、碱、抗腐蚀、抗温变形性能不同,能承受的压力也不同。必须依据样品溶剂的化学性质和离心转速选择合适的离心管。
常用的离心管:PE——聚乙烯管;CAB——纤维素管;PC——聚碳酸酯管;PP——聚丙二醇酯管
各种离心管的物理特性
PE CAB PC PP
比浓度 0.94—0.97 1.15—1.22 1.2 0.90—0.92
折射指数 1.54 1.46—1.49 1.59 1.49—1.65
负载下的温度偏差λ/℃ 60—80 46—102 132—138 99—104
水分吸收率(24h) <0.01 0.09—0.2 0.156 <0.02
拉力强度/9.8Ncm-2 218—387 183—485 562—668 232—337
伸长度/% 15—100 40—88 60—100 50—550
透明度 不透明 清澈 清澈 不透明
各种塑料离心管的化学稳定性

PE CAB PC PP PE CAB PC PP
弱酸 E E E E 甲苯 G N N G
强酸 E G G E 二甲苯 G N N G
弱碱 E E G E 汽油 G G G G
强碱 E G N E 煤油 E E E E
盐类 E E E E 石油 E E E E
稀铬酸 E G E E 植物油 E E E E
乙醇 E N G E 氯仿 E N N E
酯类 G N N E 四氯化碳 N E N N
醚类 G N N G 苯酚 E N N E
酮类 G N N G 甲酚 E N N E
苯 G N N G 0.1%间苯二酚 E E E E
E:很好,在室温下长时间(乃至一年)暴露无影响。
G;好,在室温下短时间(短于24h)暴露不致损坏。
N:不推荐使用,即使短时间暴露,都可能引起永久性损坏。
上述的塑料离心管拉力强度较大,当最大离心力超过200,000×g时,如管内样品未装满,管内外形成压差,会使管子变形甚至破裂,造成转子不平衡而发生严重事故。因此,变形的离心管要严禁使用。

四、各种离心机的性能及适用范围

常见的离心机包括:超速离心机(制备和分析)、高速冷冻离心机、大容量冷冻离心机、连续离心机、一般用途的低速离心机(无冷冻)及台式(超速、高速、低速、特殊用途)离心机等。

离心机类型及应用范围
性能及应用范围   类 型
性能:   低速 高速 超速
速度范围(×103rpm) 2—6 17—35 40—80
最大相对离心力(×103g) 6 60 600
冷冻系统 部分有 有 有
真空系统 无 部分有 有
加速/减速控制 部分有 可调 可调
应用范围:
细胞 可以 可以 可以
细胞核 可以 可以 可以
膜性细胞器 部分可以 可以 可以
膜片段 部分可以 部分可以 可以
核糖体/多核糖体 —— —— 可以
大分子 —— —— 可以

(一)低速离心机

低速离心机额定转速一般为4000rpm,且连续可调,相对离心力最大可达5000g—6000g。根据处理样品容量的大小可分为:锥型台式低速离心机和方型台式电动离心机。此类离心机体积小,重量轻,容量较大,且能自动控制工作时间,操作简单,使用方便。适用于医院化验室、生化及分子生物学试验室进行定性分析;血浆、血清、尿素、疫苗制造等。另外,还有水平桶式、大容量、带冷冻的、落地式等供分离和制备使用。
对生物制品的生产,大容量冷冻离心机可直接用于最后产品。由于此类离心机有大容量的水平及角转子,并配备强大的可调冷冻系统,使得它对于如:病毒、核酸、蛋白、激素及血液组分的分离特别有效和必不可少。同时还可用于瓶装和袋装样品的离心。
低速离心机可用于各种细菌、细胞、细胞核等分离,是最广泛使用的一类离心机。

(二)高速离心机
高速离心机最大额定转速为20,000rpm左右,最大相对离心力可达45,000g。由于运转速度高一般配备冷冻控温装置。高速离心机适用于各种生物细胞、病毒、血清蛋白等有机物、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液等样品的分离、浓缩、提取等制备工作。是细胞和分子水平研究工作的基本工具。
高速离心机的速度控制系统和温度控制系统大大的优于低速离心机。具有超速保护电路、自动速度控制、精密温度控制等。
高速离心机转子种类很多,常用的有角转子、甩平转子、水平插入式转子、连续离心转子、间歇式转子等。由于高速离心机的转速较高,离心力较大,对转子的强度要求较高,多采用超硬铝、锻铝或不锈钢加工。而且还要经过一系列安全实验。
高速离心机常用的离心管有不锈钢、铝合金、玻璃、塑料、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、硼硅酸玻璃或硼硅酸塑料等材料制成的。
小容量台式高速离心机,机型轻小,操作方便、样品量小、离心力大、自动平衡、速度可调性能稳定、安全可靠,可放在实验台、冷库或冰箱中使用。特别适用于实验室小样品的沉淀、浓缩,是分子生物学实验中使用的基本设备。

(三)超速离心机
可分为制备与分析两种。制备的最高额定转速为55,000—83,000rpm,目前已经达到120,000rpm,最大相对离心力在6×105g以上。超速离心机是医学、检验学、生物学、生物化学、分子生物学、农业等各领域和专业的重要仪器之一。可对细胞器、病毒生物大分子进行分离、浓缩及精制,并可用于蛋白质、核酸的分子量等。由于其转速极高、相对离心力极大,所以,对离心机、转子和离心管等材料和质量要求极高。

五、离心方法

制备离心方法和分析离心方法。根据待分离物质理化性质的不同,制备性离心可采用差速沉淀离心、速度区带离心和密度离心等。要获得较满意的分离效果,必须选择合适的离心转子。

离心转子的选择
转子类型   分 离 方 法
  速度沉淀 速度区带 等密度
角度转子 极好 差 好
垂直转子 差 好 极好
甩平转子 无效 好 适当
区带转子 差 极好 适当

(一)差速沉淀离心

分别改变离心速度用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀的方法。它比较适用于沉降速度差别在一到几个数量级的混合样品的分离,对于差别较小的物质难以得到满意效果。
差速分离一般采用角转子。离心开始时,所有颗粒均匀的分布在整个离心管,离心期间各种颗粒以不同的速度向管底沉降,经一定时间后,最重的颗粒全部沉到管底并得到不含这种颗粒的上清液,然后将上清液以更高速度离心一段时间,又得到次轻的颗粒,逐渐增加离心速度,可以分批得到不同质量的物质,达到分离目的。
但是,每次得到的沉淀并不是均一的。这是由于离心前大小颗粒均匀分布,而在大颗粒沉降到管底时将一部分小颗粒裹挟在一起一块沉到管底。所以要想得到较纯的大颗粒沉淀,就要反复将沉淀进行重新均匀分布,再以原来条件反复离心,称为“洗沉淀”。每次产生的上清液合并,以更高速度离心分离。
差速离心也可达到分级分离的目的。为了不使各种颗粒的混合物充满离心管,通过在样品与管底之间制造一个:“空层”。它可以阻止比空层密度小的颗粒通过。一般常采用蔗糖溶液作为“空层”。这种分离只能在摔平转子中进行。

(二)速度区带离心

将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降。样品的颗粒按照其不同的沉降速率沉降,从而互相分离。离心一定时间后不同大小的颗粒将沉降于不同的层次,产生所谓“区带”。由于是根据颗粒的沉降速率来完成分离,且离心过程中形成区带,所以称作:速度区带离心。这种方法适用于分离密度相似而大小有别的样品。
本方法一般使用甩平转子或区带转子。样品加在事先装好的介质梯度上,离心中最重的颗粒迅速向离心管底部或外周移动。形成一定宽度的区带,同时维持这种区带形状不变,即为原始层(第一层)。随后较轻的颗粒逐渐形成多个层面。一段时间后,具有不同沉降速率的颗粒产生了彼此分离的区带。停止离心后,依次收集各个区带。与差速沉淀离心法相比,一次离心就能同时分离、纯化不同大小的颗粒而不必分开进行。
速度区带离心的影响因素:
沉降过程中液体对流可以引起溶液混合,影响区带形成。防止对流的有效手段是沿旋转半径从中央到外围增加液体的密度。即形成溶液浓度从液面到管底部逐渐增加“密度梯度”。而样品加在梯度溶液上面。
沉降过程中旋转半径r的改变是影响区带形成的另一因素。v=6.092×10-4×D2(ρ-ρm)n2r/ηm由于颗粒沉降速度随旋转半径的增加而增加。有可能在较轻的颗粒离开液面一定距离并相互分开形成各自的区带之前,较重的颗粒已经到达管底部,使得已经分开的区带又混合起来形成沉淀影响分离效果。克服这种影响的的方法是通过沿半径方向逐渐增加介质的密度(ρm)和年度(ηm)来防止。

1、  介质梯度密度的特征和制备

介质梯度密度主要用来克服对流和r增加的影响。介质的密度沿半径方向逐渐增加,梯度的最大密度小于样品混合液的最小密度。装好梯度液后,将样品铺在梯度液的顶部,即可离心。

密度梯度溶液可手工制备、仪器制备或冷冻法制备:
(1)  手工制备:先以不同浓度(梯度)的溶液按由稀到浓依次铺入离心管,形成不连续的阶梯密度
溶液将离心管垂直静置在室温下2—3h,即会因重力作用及扩散作用形成连续近线性密度梯度溶液。
(2)  仪器制备:直接使用“密度梯度形成——收集仪”制备
(3)  冷冻法制备:使用浓度等于高、低平均值的蔗糖或其他梯度溶液,等量放入离心管中,然后垂直 放置在-20—-40℃低温箱中冻结后取出,在室温下静置熔化,如此反复二次即形成近直线型梯度分布。
2、  速度取带离心介质的选择
在速度区带离心中用作密度梯度溶质的物质有很多种。
密度梯度材料的种类和主要性能

材料名称 相对分子量 可制备最大密度 用途
氯化铯 169.4 19.—1.98 DNA、RNA、核蛋白体
硫酸铯 361.9 1.9—2.01 DNA、RNA
NaBr 102.91 1.53 脂蛋白
NaI 149.9 1.9 DNA、RNA
酒石酸钾 235.3 1.49 病毒
蔗糖 342.3 1.35 极广泛
(+葡萄糖) —— 1.35 染色体
(+重水) —— 1.24左右 核糖核蛋白体
甘油 92.09 1.26 膜片段、核片段、蛋白
山梨醇 —— —— 病毒、酵母等
重水 20 1.11 肌动蛋白
Ficoll 400,000 1.23 极广泛
右旋糖苷 72,000 1.05 微粒体
牛血清白蛋白 69,000 1.92 整细胞分离
水合氯醛 165.4 1.91 染色体

(1)  蔗糖溶液:速度区带离心中形成密度梯度最常用的溶质。不同浓度(重量%)的蔗糖溶液具有不同的密度和粘度,随温度生高,密度和粘度都会降低。利用蔗糖密度梯度溶液分离样品,不仅取决于蔗糖浓度而且要考虑样品密度。适中的蔗糖溶液(<40%)可用于蛋白质和核酸的速度区带分级分离。冈崎片段就是利用此方法发现的。
(2)  甘油:高浓度甘油粘度的增加较蔗糖和Metrizamide(三碘苯酸衍生物)缓慢,其密度也较低。但甘油浓度在达到蔗糖浓度两倍时才具有与蔗糖溶液相同的密度。因此,甘油密度梯度离心主要用于一些如酶的活力研究等特殊情况。
(3)  Metrizamide(三碘苯酸衍生物):相对分子量789。本身密度2.17g/cm3,惰性较强,在很宽的pH范围(2.5—12)内保持稳定。它的粘度和密度两方面等比蔗糖理想。在相同的浓度下其粘度比蔗糖低一些,而密度明显比蔗糖高。这样,形成稳定的密度梯度所需的浓度较蔗糖低的多。然而由于核酸在其中浮力密度太低;价格比蔗糖昂贵;对紫外光有吸收等缺点它主要用于等密度离心中,而几乎不用于速度区带离心中。
(4)  Ficoll:是蔗糖与环氧丙烷的高分子聚合物。相对分子量400,000,在水中溶解度很高,在较宽的pH范围较稳定(pH<3可水解)与蔗糖溶液相比密度低但粘度较高。它常用于细胞、细胞器及膜上颗粒离心分离。Ficoll也与Metrizamide的钠盐混合使用。一定比例的这两种物质混合物具有1.077g/cm3的密度,而且粘度和渗透压比较低,常用于离心纯化淋巴细胞。

3、区带转子中的离心

区带转子主要用于从大量样品中对大分子或颗粒进行蔗糖密度梯度的速度区带离心,主要是制备性的分离与纯化。其操作步骤为4步:
(1)  装载梯度溶液(制备梯度):区带转子在开始离心时转子是空的。当转速达到3000—4000rpm称为“装样速度”时,外部装置将梯度液泵入转子,梯度液通过穿通四个隔板的孔道到达转子内室的周边,首先泵入最低密度溶液,密度逐渐增加。此时,原先在转子中较低密度溶液被推向中心,最后泵入最高密度溶液指导充满转子。密度最高的一层称为“垫衬层”。充满后的转子形成随半径增加的密度梯度。
(2)  加入样品和覆盖层:仍在装样速度下,通过到达转子中心的孔道将样品溶液加入梯度的顶部(接近旋转中心);然后再将覆盖层(密度低于样品溶液)加在样品上。此时将有一部分垫衬层溶液通过隔板上的孔道流出转子。
(3)  离心分离:将转子加速到分离速度,离心一段时间,使各区带分离达到最佳分离状态。
(4)  取样:将转速降至取样速度(同装样速度),通过隔板中的孔道将与垫衬层密度相同的溶液不断泵至周边,则从中心孔道流出不同密度溶液,对流出液进行部分收集,得到被分离的各个组分,直到转子中充满垫衬层溶液(收集到垫衬层溶液),取样工作结素。

(三)等密度离心

又称平衡离心。样品被置于一个较陡峭的密度梯度中沉降。该梯度的最大密度高于样品混合液的最大密度,梯度的最小密度低于样品混合液的最小密度,当样品颗粒沿梯度运动到与颗粒的浮力密度相同的密度层时,就停止了运动,经过一段较长时间的离心,样品中所有不同密度的颗粒都将停止在各自的等密度区域。即为根据颗粒各自不同的浮力密度而进行分级分离。此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。
等密度分离一般使用角转子或甩平转子。样品溶液一般与密度梯度溶液介质混合在一起装入离心管。离心时,介质产生沿半径方向增加的密度梯度,样品颗粒则向等密度区运动。当所有颗粒都完全沉降到各自等密度区域后,停止离心。分部收集不同密度的溶液,即可得到被分离的样品颗粒。
特点:
(1)? 离心时间长。
(2)? 不需粘性介质。
(3)? 颗粒的最终分布与其大小和质量无关,无论其初始迁移率如何,在给定梯度中颗粒位置只受其浮力密度的影响。
(4)? 到达平衡位置的颗粒,一方面来源于比其浮力密度低的低密度区,一方面来源于高密度区。即
漂浮与沉降同时发生。因此,等密度离心样品溶液可以与整个梯度溶液相混合。
(5)? 样品装载容积较速度区带离心大,而且不会形成局部反向梯度。

1、? 介质密度梯度的特征和制备
采用介质密度梯度的主要目的是形成一系列具有不同密度的区域,以使具有不同浮力密度的颗粒处于其等密度区而彼此分离。介质的密度沿旋转半径增加,接近管底的密度高于样品的最大密度,液面部分的密度低于样品的最小密度。
等密度离心的介质密度梯度一般采用离心方法来制备。如;高浓度盐溶液,在离心力作用下,盐离子依次向管底沉降,形成从液面到管底逐渐增加的密度梯度,同时溶质的扩散又会阻碍这种梯度形成,经过足够时间离心后,两个过程可达到平衡,形成盐溶液密度梯度,并在某一转速下保持稳定。

2、等密度离心介质的选择
由于核酸的浮力密度比高浓度的蔗糖和甘油的最大密度高,甘油和蔗糖都不适合这种密度梯度。常用于等密度梯度离心的物质有高浓度盐溶液和Metrizamide。
(1)高浓度盐溶液:应用广泛的盐饱和溶液具有较高的密度。硫酸铯2.01g/cm3;氯化铯1.91g /cm3;碘化钾1.72g/cm3。盐的选择主要取决于高浓度盐溶液的密度与待分离样品的浮力密度之间的关系。氯化铯密度梯度溶液主要用于DNA的分级分离,也可利用沉淀作用对少量RNA进行纯化。硫酸铯密度梯度主要用于RNA的分级分离。三氯乙酸铯密度梯度能够对RNA进行分离,并可使核糖核酸酶失活,同时使DNA和蛋白质与RNA分开,也可从DNA和RNA中分离出DNA―RNA的杂交体。三氯乙酸铷密度梯度用于分离变性DNA和天然DNA。碘化钠密度梯度广泛应用于各种天然和变性DNA的分离。碘化钾密度梯度也可用于分离DNA―RNA杂交体。溴化钠和溴化钾密度梯度较多地用于血浆脂蛋白的分离。
(2) Metrizamide密度梯度:主要用于等密度离心中,与密度梯度相比它具有:化学性质稳定,解离作用低;生物多聚体在其中的浮力密度低的特点,其缺点是粘度大。40%―50%的Metrizamide溶液,可用来分离蛋白质,特别是核蛋白,加入各种盐和改变pH可引起核酸浮力密度的变化而有助于其分级分离。

(五)离心操作要领

1、精确地平衡离心管和它们的内容物是十分重要的。超速离心机转子是镶置在一根很细的轴上,因此在两只离心管平衡时,重量之差不得超过各种离心机说明书上所规定的范围。制备性超速离心机两离心管重量之差不得超过0.1g。有套筒的离心管应带套筒一起平衡。离心管套筒严禁在不同离心机之间混用(特别是不同型号离心机)。
2、平衡后的离心管和内容物(包括套筒)应对称放置,不能错位。不可装载单数管子,避免离心力不对称损坏离心轴,造成严重事故。
3、平衡好的离心管对称放好后盖好离心机盖,打开电源,设置离心机转速和离心转速。
4、当到达离心时间时,开启减速或速度调节旋钮减速。待离心机自然停止转动后,开盖取出离心管。关闭电源,拔掉电源插头。清洗离心机、离心室、离心管、套筒等。
5、超速离心机带有自动控制操作系统,设定离心速度、(或离心力、角速度)离心时间、温度、真空度等参数后,开启开关,离心机自动开启真空泵、冷冻机待达到设定的温度、真空度等参数后转速上升达到设定转速后,记录时间,达到离心时间后自动停机,减速装置自动开启。
6、使用超速离心机时,应特别注意选择合适的离心管和转子。根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满,以免离心管变形。根据转速选择转子,当转速超过所用转子额定转速2.5%时,转子会爆炸!一般转子下面装有限速环。转子在使用前要放入冰箱中预冷。离心后,转子用温水洗涤并干燥,一般可用水洗,去污剂应使用随机所带的中性去污剂。不可将转子放在去污剂中洗涤,洗后用水冲净去污剂,再用蒸馏水冲净。擦干后,用吹风机吹干(也可放在室温下干燥)。长期不用时,要涂一层上光蜡保护。转子应防止与其它物品碰撞,避免造成伤痕。如发现有被腐蚀的迹象或伤痕,转子不应再用!

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇Column Purification of Demethylated Sphingomyelin 柱纯化脱甲基鞘磷脂 下一篇离心技术基础

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条