说明:
进入90 年年代以后用 DNA 测序法或在 260nm 波长加温溶点法进行测定比离心法更简单,究竟用什么方法要由使用单位现有设备来决定。在不用 E.B. (溴乙锭)的情况下,用 CsCl 梯度分离 DNA 一般不会影响 DNA 的构型。某些梯度材料如 Cs 2 SO4 在离心过程中形成的密度梯度太陡而不适合做质粒 DNA 离心。某些非电离性的梯度材料(如 Nycodenz )也不适用于此类离心。
例( 4 )用 CsCl 梯度纯化 RNA 配置溶液: I : 7.5M 氯胍, 50mM 醋酸纳( PH7.0 ) 0.1M 2- 巯基乙醇, 0.5% Sarkosyl 。 II : 10mMTris-HCl ( PH7.4 ), 2Mm EDTA 。
实验步骤
( i )在溶液 I 中制备细胞匀浆 , 每克细胞加入 10ml I 溶液 . ( ii ) 匀浆离心 , 8,000rpm( 约 8,000xg), 5 ℃ ,10 分钟 , 固定角式转头 ,PA 或 PP 离心管。离心后倒出上清液备用。 ( iii )用容量为 13-14ml ,最高转速在 40,000-41,000rpm 的甩平转头,钛合金吊桶, PA 离心管,每管下部铺设 2ml , 5.7M CsCl (在溶液 II 中),上部为( ii )离心后的上清液。离心转速 31,500rpm (约 185,000xg ), 10 ℃ 离心 18 小时,或用固定角式转头,每管下部铺设 3ml , 5.7M CsCl (在 II 中),上层的( ii )离心后的上清液, 65,000rpm (约 410,000xg ), 10 ℃ ,离心 2 小时(慢加速,慢减速)。 ( iv )离心后,小心地倒去上层蛋白质,中层的 DNA ,已经初步纯化的 RNA 沉淀在离心管底部。 ( v )沉淀中加入 0.5ml 溶液 I 并移入 1.5ml eppendorf 管,再在微量离心管中加入 0.5ml 溶液 I ,摇匀。 ( vi )在离心管中加 50 μ l , 1M 醋酸(在 500 μ l 乙醇中)。 ( vii )离心管置于低温冰箱中 -20 ℃ 静置 1 小时以上。 ( viii )台式离心机 12,000rpm (约 11,000xg )离心 10 分钟。倒去上清液,沉淀为 RNA (进一步纯化的)。 ( ix )沉淀溶于 400 μ l 溶液 II 并假如 40 μ l 3M 醋酸纳( PH5.0 )(在 880 μ l 乙醇中)。 ( x ) -20 ℃ 静置过夜。 ( xi )第二天,用高速台式离心机 12,000rpm (约 11,000xg )离心 10 分钟,倒去上清液,沉淀用 70% 乙醇洗二次。 ( xii )将 RNA 溶于 II ,用凝胶电泳检测(用薄层扫描仪或凝胶电泳分析仪分析结果) RNA 构型,用分光光度计( 1 毫克 / 毫升 RNA 在 260nm 时光密度为 25 )测定 RNA 浓度。 ( xiii )将已知构型及浓度的 RNA 在 -20 ℃ 储存。
例( 5 ):用 KI 梯度分离 RNA 片断。 ( i ) 将 DNA 样品溶于 15mM 柠檬酸钠, 10mM 亚硫酸钠, 5mML 磷酸钠( PH7.0 )中,最终浓度不超过 50 μ g/ml 。 ( ii ) 每毫升 RNA 溶液加入 1.0 克 KI ,充分溶解后用折射仪测定 RI=1.4290 ,如过高,过低必须修正到比值。 ( iii ) 将以上溶液充满 12ml , PA 快速密封离心管,密封后置于固定角式转头中, 150,000xg , 20 ℃ 离心 60 分钟。 ( iv ) 分部收集离心管中梯度液( 30-50 管),可用 RNA 试剂定位,如果 RNA 已做同位素标记,可用液闪仪定位。如果用后一种方法,在分部收集管每管中加一滴( 25 μ l 左右)巯基乙醇以避免在液闪仪液体中产生自由离子。 ( v ) 用此法可以分离单股与双股 RNA 。
例( 6 )用 Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子 样品:初步离心后的蛋白 - 核酸混合液 梯度液: 3.00g Cs2SO4 2.5ml 8M 尿素(经过混合床去离子处理的) 50 μ l 1.0M Tris-HCl ( PH7.4 ) 25 μ l 0.2M EDTA ( PH7.4 ) 1.25ml 样品的水溶液 以上各项充分混合后注入 5ml PA 快速密封管 固定角式转头 130,000xg , 5 ℃ 离心 64 小时,慢减速或 600,000xg , 5 ℃ 离心 14 小时,慢减速甩平转头 400,000xg , 5 ℃ 离心 22 小时
结果分析:其中蛋白用 35S 同位素标记。RNA , DNA 用 32P 同位素标记。离心后样品分布收集成 30 管,在液闪仪上测定,绘出从离心管表面— > 管底的容量为横坐标,同位素 32P , 35S 计数为纵坐标的曲线图,很明显可以找到蛋白, DNA , RNA 的峰位置。
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