(一)细菌的收获和裂解 1.收获 1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中,然后接入一单菌落,于30℃剧烈振摇下培养过夜。 3.煮沸裂解 该法根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成。 1)将细菌沉淀[收获细菌和步骤3)所得]重悬于350μlSTET中。 2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制],振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。 i.当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101 )中小量制粒DNA时,建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9)之间增加一步,即用酚:氯仿进行抽提,可以避免这一问题。 ii.此法制备的高考贝数质粒(如Xf3哉pUC),其产量一般约为:每毫升原细菌增减物3-5μg。 iii.如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1μlDNA溶液加到另一个含8μl水的微量离心管内,加1μl 10x限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜温度温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开,很有可能在收获细菌的步骤3)或上述步骤8)未能很好地去除所有液体。这种情况下,可用酚:氯仿抽提DNA终产物,然后用乙醇重新沉淀DNA,通常,用5-10倍过量的酶(特别是并不昂贵的酶)在100-200μl 体积中进行消化,可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后, 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积乙醇沉淀DNA。 |
(二)质粒DNA小量制备的问题与对策 裂解和煮佛法都极其可靠,重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来,在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中,只碰到过两个问题: 1)有些工作者首次进行小量制备时,有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割,这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下,用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在,可用离心柱层析注纯化DNA。 2)在十分偶然的情况下,个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。 |
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