当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般最多能结合15~20个,一个IgG分子可结合2~8个分子的FITC,其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1.Marsshall法 (1)材料 抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/LPBS等。 (2)方法及步骤 ①抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。 注:A为蛋白含量,mg/ml;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mg;D为常数,mg;正为荧光素的量,mg;F为碳酸盐缓冲液的容积,ml;G为PBS的容积,ml。 2.Chadwick法 (1)试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。 (2)方法及步骤 ①抗体准备 用o~4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中。 |
3.改良法 (1)试剂和材料 ①0.01mol/L(pH7.2)PBS配法中,校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸馏水 (2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水(0.15mol/LNaCl)及缓冲液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03,pH9.0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg,缓冲液为总量的10%,降温至4℃。 4.透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少。 (1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。 (2)方法及步骤 ①用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0,将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度,装入透析袋中。 |
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