一、组织抽提: 1. 取组织块50-100┦用液氮在研钵中研磨成粉末 2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4. 冰上孵育5分钟 5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管 6. 加0.2 ml氯仿,震荡,冰上孵育5分钟 7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管 8. 加0.5 ml异丙醇,震荡,冰上孵育5分钟 9. 离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液 10. 加入1 ml 75%乙醇,震荡 11. 离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液 12. 室温下使之变透明 13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA( 可保存在液氮或低温冰箱) 14. 走RNA变性电泳观察18s,28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度 二、RT反应体系(第一步):约20分钟 RNA 抽提物 5μl Radome 引物 2μl RNA sin 0.5μl 1. 65℃ 15分钟 2. 立即放入冰浴 |
RT反应体系(第二步):约2小时 RNA sin 0.5μl 10mM dNTP 1μl 5×RT 缓冲液 4μl 25mM MgCl2 4μl AMV 逆转录酶 3μl 1. 37℃ 1.5小时 2. 94℃ 5-10分钟 3. 反应物保存于-20℃或进行PCR 三1、PCR反应体系:约4.5小时 25mM MgCl2 2μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 2.5μl ddH2O 34μl Taq酶 0.5μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1. 94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2. 94℃ 45秒,55℃ 40秒,72℃ 1分钟 为第二步30个循环 3. 72℃ 10分钟 4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 |
三2、PCR反应体系:约5小时 25mM MgCl2 3μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 5μl ddH2O 30μl Taq酶 1μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1. 94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2. 94℃ 45秒,50℃ 40秒,72℃ 1分钟 为第二步40个循环 3. 72℃ 10分钟 4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 四、电泳:约1.25小时 1. 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml 2. 胶浓度1.7%(40ml 0.5×TBE加0.68g胶) 3. 微波炉中火2分钟溶解胶 4. 冷却至60℃加入溴乙锭2μl(10mg/ml的终浓度0.5μg/ml) 5. 放入梳子,浇板,待凝固 6. 加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰 7. 电泳50-80V(每┩ 5V) |
词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0