问：简并引物的简并度并没有超过512，但是PCR时总是不能得到特异的带，只是在预定的位置出现一片弥散的带。后来提高模板浓度，并将退火温度从 50℃ 提高至65℃，做单引物对照即只加一条引物时能扩增出特异的带，而正常PCR却什么也扩增不出来，偶尔能扩增出一些片断也跟单引物对照的是一样的。并且重复性不好，有时能扩增出来有时什么都没有。确定模板没有问题，因为16S能扩增出来。请各位支招，感激不尽！

答：可以尝试锚定PCR!也可以用touch-down PCR方法，很多可能条件摸索不好！不知道你所沿环境基因组是什么意思？如果生物个体上，可能存在组织特异性，提取不同组织试探！

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