问:我想知道,用什么方法进行酶标记可以非常有效呐?过碘酸钠标记怎么样? 答:第一节 间接法测抗体 基本原理 将特异性抗原包被在固相载体上,形成固相抗原,加入待检标本(含相应抗体),其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物,再加入酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体,亦称二抗),与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物,复合物上的酶则催化底物而显色(反应过程见图1-1)。 试剂与设备 实验步骤 一 予试验 (一)抗原包被的酶标板的制备 (二)底物浓度的摸索 在底物缓冲液中加入不同量的底物(参考:5mg/10ml),加入酶标板中(50ul/孔),以胶带封口,37℃避光保存2h,在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。 (三)酶标抗体浓度的摸索 用稀释液稀释酶标抗体至适当倍数(参考:40~4000倍),加入已包被抗原的酶标板中(50ul/ 孔),封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次,然后于吸水纸上拍干,加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h,在没有变色的条件下选择尽可能大的酶标抗体浓度。 |
(四)待测标本浓度的摸索 选择明确为阴性的标本,以稀释液做适当稀释(至少5倍以上,参考:100倍),封口后于37℃作用1h,按上述条件洗板(连续冲洗5次),加入已确定浓度的酶标抗体,再洗板,再加入已确定的底物,选择无明显发色的最大浓度的标本。 二 正式试验 1. 以稀释液将待检标本做适当稀释(予试中确定)加入包被有已知抗原的酶标板中(50ul/孔),加封口胶带于37℃作用30min. 注意事项 1. 每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照(以PBS代替标本),后者为本底值,在分析实验结果时应扣除本底值,阳性对照>阴性对照>空白对照实验成立。 参考文献 (刘辉 程桂芝) 1.我当时是采用western-blot方法中确定的阳性标本作为对照。 |
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