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蛋白质的检测、鉴定、回收与浓缩

标签: 蛋白质 分离 纯化 透析

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蛋白质的检测、鉴定及回收编辑本段回目录

检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R-250(CBB,Coomassie brilliant blue),通常是用甲醇:水:冰醋酸(体积比为45:45:10)配制0.1%或0.25%(W/V)的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸-甲醇溶液使蛋白质变性,固定在凝胶中,防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散,通常染色需2小时。脱色液是同样的酸-甲醇混合物,但不含染色剂,脱色通常需过夜摇晃进行。考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度,在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1 mg的蛋白质形成的染色带。考马斯亮蓝与某些纸介质结合非常紧密,所以不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜以及蛋白质印迹(在硝化纤维素纸上)。在这种情况下通常是用10%的三氯乙酸浸泡使蛋白质变性,而后使用不对介质有强烈染色的染料如溴酚蓝、氨基黑等对蛋白质进行染色。
银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法,它是通过银离子(Ag+)在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带的。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行,这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨,而细小的考马斯亮蓝染色检测不到的蛋白带由银染检测。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍,可以检测低于1 ng的蛋白质。
糖蛋白通常使用过碘酸-Schiff试剂(PAS)染色,但PAS染色不十分灵敏,染色后通常形成较浅的红-粉红带,难以在凝胶中观察。目前更灵敏的方法是将凝胶印迹后(下面介绍)用凝集素检测糖蛋白。凝集素是从植物中提取的一类糖蛋白,它们能识别并选择性的结合特殊的糖,不同的凝集素可以结合不同的糖。将凝胶印迹用凝集素处理,再用连接辣根过氧化物酶的抗凝集素抗体处理,然后再加入过氧化物酶的底物,通过生成有颜色的产物就可以检测到凝集素结合情况。这样凝胶印迹用不同的凝集素检测不仅可以确定糖蛋白,而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。
通过扫描光密度仪对染色的凝胶进行扫描可以进行定量分析,确定样品中不同蛋白质的相对含量。扫描仪测定凝胶上不同迁移距离的吸光度值,各个染色的蛋白带形成对应的峰,峰面积的大小可以代表蛋白质的含量的多少。另外一种简单的方法是将染色的蛋白带切下来,在一定体积的50%吡啶溶液中摇晃过夜溶解染料,而后通过分光光度计测定吸光度值就可以估算蛋白质的含量。但应注意,蛋白质只有在一定的浓度范围内其含量才与吸光度值成线性关系,另外不同的蛋白质即使在含量相同的情况下染色程度也可能有所不同,所以上面的方法对蛋白质含量的测定只能是一种半定量的结果。
尽管凝胶电泳通常是作为一种分析工具使用,它也可以用于蛋白质的纯化制备。但电泳后需将蛋白质从凝胶中回收,通常是将所需的蛋白质区带部分的凝胶切下,通过电泳的方法将蛋白质从凝胶中洗脱下来(称为电洗脱)。目前有各种商品电洗脱池装置。最简单的方法是将切下的凝胶装入透析袋内加入缓冲液浸泡,再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳,蛋白质就会向某个电极方向迁移而离开凝胶进入透析袋内的缓冲液。由于蛋白质不能通过透析袋,所以电泳后蛋白质就留在透析袋的缓冲液中。电洗脱后可通一个反向电流,持续几秒钟,使吸附在透析袋上的蛋白质进入缓冲液,这样就可以将凝胶中的蛋白质回收。

蛋白定量技术编辑本段回目录

(一)双缩脲测定法
1.原理  蛋白质中的肽键有双缩脲反应,在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物,在一定的范围内,颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强,游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应,但此法不够敏感,仅能测出毫克水平。
    2.试剂配制
     硫酸铜(CuSO4•5H2O)               1.50g
酒石酸钾钠                           5.00g
H2O                                500.0ml  
10%氢氧化钠(不含硫酸钠)          300ml
H2O           加至                 1 000ml
此溶液可长期保存,如产生暗红色沉淀,则应废弃重配。
    3.标准曲线的制备
     ⑴ 准确称取牛血清白蛋白1.0g(必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量,然后换算),以生理盐水配成1%的浓度。
⑵ 将1%的牛血清白蛋白按表8-1进行稀释:
表8-1 牛血清白蛋白稀释方法表
成     分 试            管             号
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1%蛋白液(ml) 1.0 .09 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -
蛋白含量(mg) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -
生理盐水(ml) 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
试剂蛋白含量(mg) 8.0 7.2 6.4 5.6 4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8 0
注:1%牛血清白蛋白,经凯氏定氮测定含纯蛋白为80%。
⑶ 混匀后于室温放置0.5h~1h,光电比色(540nm),顺序由低浓度至高浓度,每管测3次,求其平均值。
⑷ 以OD值为纵坐标,蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4.样品测定
⑴ 取样品0.1ml,加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml,再加生理盐水0.5ml。
⑵ 加双缩脲试剂4.0ml,混匀,至室温0.5h~1h。
⑶ 另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷ 测OD540值。
⑸ 根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意:各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异,一旦标准曲线制定后,样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致,否则结果有差异。
(二)紫外光谱吸收法
1.原理  本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸-色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰,其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高,可测到微克水平,操作简单,不需要加各种试剂,测完后,样品可回收。
    2.标准曲线的制备
    ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg,溶于50ml生理盐水中。
    ⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg,以盐水对照。
    ⑶ 测各管OD280值。
    ⑷ 以OD280值为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
    3.样品测定
将待测样品以盐水适当稀释,在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间,以生理盐水为对照,测OD280值,从标准曲线上查出蛋白含量。
(三)Folin酚法
    1.原理  蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后,在碱性条件下不稳定,被还原成蓝色的化合物(钼蓝)。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高,且不受溶液中脂多糖的干扰。
    2.试剂
    试剂甲:
A液:Na2CO3                 10.00g
      NaOH                   2.00g
      酒石酸钾钠(或钾盐钠盐)0.25g
     混合、溶于500ml蒸馏水中。
B液:CuSO4•5H2O               0.5g
       H2O                 100.00ml
        用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙:
   于磨口回流瓶加入下列试剂
   Na2WO4•2H2O                100.00g
   NaMoO4•2H2O                 25.00g
   H2O                          700.00ml
   85%H3PO4                      50.00ml
   浓HCl                         100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加:
   硫酸锂                       150.00g
   H2O                          50.00ml
   溴水                          数滴
开口继续沸腾15min,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色微带绿色(如仍呈绿色,须重复滴加液体溴步骤)。稀释至1L,过滤,滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定,以酚酞为指示剂,然后适当稀释(加水约1倍)使最终浓度为1mol/L。
3.标准曲线的制备
⑴ 取标准牛血清白蛋白2.50mg,溶于10ml蒸馏水中,使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀释。
表8-2 标准曲线稀释方法
成分 试          管            号
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
牛血清白蛋白标准品(ml) 0 0.2 0.2 0.4 0.1 0.6 0.6 0.8 0.8 1.0 1.0
生理盐水(ml) 1.0 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0
蛋白含量(μg/ml) 0 50 50 100 100 150 150 200 200 250 250
⑶ 每管加试剂甲5ml,混合后室温放置10min,再加0.50ml试剂乙(即Folin酚试剂),立即摇匀(否则显色降低)。
⑷ 30min后测OD650nm。
⑸ 以OD为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
    4.样品测定
    ⑴ 待测样品1ml(适当稀释至约含25μg-250μg/ml)。
    ⑵ 加试剂甲、乙。
    ⑶ 比色、测OD650值。
⑷ 查标准曲线,求蛋白含量乘以稀释倍数,即为样品的蛋白含量。
(四)紫外分光测定法
A1%1cm=13.8(IgG)(280nm)
A1%1cm=14.5(IgM)(280nm)
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.74OD260  (此为经验公式,即以不同浓度的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的)。

蛋白质分离纯化方法的选择编辑本段回目录

(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。
(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex
ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。
(三)根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)
(四)根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法
亲和层析法(aflinity
chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)
和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。

蛋白质的浓缩技术编辑本段回目录

蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段,现介绍几种常用的浓缩技术。
(一)透析袋浓缩法
利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),结扎,把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。
(二)冷冻干燥浓缩法
这是浓缩蛋白质的一种较好的办法,它既使蛋白质不易变性,又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻,然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂,如NaOH、CaCl2和硅胶等)。密闭,迅速抽空,并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便,应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。
(三)吹干浓缩法
将蛋白溶液装入透析袋内,放在电风扇下吹。此法简单,但速度慢,且温度不能过高,最好不要超过15℃。
(四)超滤膜浓缩法
此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出,而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩:一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内,在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上,负压抽气,而使袋内液体渗出。
(五)凝胶浓缩法
选用孔径较小的凝胶,如SephadexG25或G50,将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内,凝胶粒子吸水后,通过离心除去。
(六)浓缩胶浓缩法
浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物,具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml~150ml。它能吸收低分子量的物质,如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等,适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后,蛋白质的回收率可达80%~90%。比浓缩胶应用方便,直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意,浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点,否则在浓缩胶表面产生阳离子交换,影响浓缩物质的回收率。

透析法与透析袋编辑本段回目录

  透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,而大分子物质不能通过半透膜的性质,达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时,可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内,而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中,而加以分离精制:透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小,要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜(硫酸纸膜)、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状,外面用尼龙网袋加以保护,小心加入欲透析的样品溶液,悬挂在清水容器中。经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大,必要时适当加热,并加以搅拌,以利透析速度加快。为了加快透析速度,还可应用电透析法,即在半在半透膜旁边纯溶剂两端
  放置二个电极,接通电路,则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动,而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动,中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全,须取透析膜内溶液进行定性反应检查。
  一般透析膜可以自制:动物半透膜如猪、牛的膀胱膜、用水洗净,再以乙醚脱脂,,即可供用;羊皮纸膜可将滤纸浸入50%的硫酸15~60分钟,取出铺在板上,以水冲洗制得。其膜孔大小与硫酸浓度、浸泡时间以及用水冲洗速度有关;火棉胶膜系将火棉胶溶于乙醚及无水乙醇,涂在板上,干后放置水中即可供用,其膜孔大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关,溶剂中加入适量水可使膜孔增大,加入少量醋酸可使膜孔缩小;蛋白质胶(明胶)膜可用20%明胶涂于细布上,阴干后放水中,再加甲醛使膜凝固,冲洗干净即可供用。近来商品有透析膜管成品出售,国外习称“ViskingDialysisTubing”,有各种大小厚度规格,可供不同大小分子量的多糖、多肽透析时选用。  透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,就叫做透析袋。
  自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
  透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
  透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度,通常是4℃透析,升高温度可加快透析速度。
  透析膜可用动物膜和玻璃纸等,但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜,目前常用的是美国Union Carbide (联合碳化物公司)和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管,截留分子量MwCO(即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量,缩写为MwCO)通常为1万左右。
  商品透析袋制成管状,其扁平宽度为23 mm~50 mm不等。为防干裂,出厂时都用10%的甘油处理过,并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,它们对蛋白质和其它生物活性物质有害,用前必须除去。可先用50%乙醇煮沸1小时,再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明,50%乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中,若长时间不用,可加少量NaN2,以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口,用时必须仔细检查,不漏时方可重复使用。
  新透析袋如不作如上的特殊处理,则可用沸水煮五至十分钟,再用蒸馏水洗净,即可使用。使用时,一端用橡皮筋或线绳扎紧,也可以使用特制的透析袋夹夹紧,由另一端灌满水,用手指稍加压,检查不漏,方可装入待透析液,通常要留三分之一至一半的空间,以防透析过程中,透析的小分子量较大时,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时,体积增加50%是正常的。为了加快透析速度,除多次更换透析液外,还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些,可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析,可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下。
  检查透析效果的方法是:用1% BaCl2检查(NH4)2SO4,用1% AgNO3 检查NaCl、KCl等。
  为了提高透析效率,还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司(Biomed Instruments Inc.)生产的各种型号的Zeineh 透析器,由于使用对流透析的原理,使透析速度和效率大大提高。

蛋白质印迹(Western blotting)编辑本段回目录

印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上,通常有两种方法:毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上,在凝胶上放一片硝酸纤维素膜,再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好,缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上,硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜,就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低,通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质(10%~20%)。电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状,而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳,选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。
转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如10%的BSA)处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点,而后用所要研究的蛋白质的抗血清(一抗)处理,印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合,而其它蛋白质不与一抗结合,这样清洗去除未结合的一抗后,印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二抗是抗鼠Ig G的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合,可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定Ig G的抗体可以直接购买作为标记的二抗。最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处理后,再用适当的底物溶液处理,当酶纯化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要研究的蛋白质的位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物;而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物,将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法,辣根过氧化物酶在H2O2存在下,氧化化学发光物质鲁米诺(luminol,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍,通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。除了酶连二抗作为指示剂,也可以使用其它指示剂,主要包括以下一些:
I125标记的二抗:可以通过放射性自显影检测。
荧光素异硫氰酸盐标记的二抗:可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。
I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A):Protein A可以与Ig G的Fc区特异性的结合,因此Protein A可以代替二抗:I125标记的Protein A通过放射性自显影检测。
金标记的二抗:二抗通过微小的金颗粒包裹,与一抗结合时可以表现红色。
生物素结合的二抗:印迹用生物素结合的二抗处理后,再用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合,这种方法实际上相当于通过生物素与凝集素的紧密结合将二抗与酶连接,通过酶的显色反应就可以进行检测。这种方法的优点是由于生物素是一个小分子蛋白,一个抗体上可以结合多个生物素,也就可以结合多个酶连接的凝集素,可以大大增强显色反应的信号。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外,有时也使用其它探针如放射性标记的DNA,可以检测印迹中的DNA结合蛋白。
 
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丙烯酰胺凝胶电泳编辑本段回目录

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点:
①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易和样品相互作用。
    ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质,在聚合前可调节单体的浓度比,形成 不同程度交链结构,其空隙度可在一个较广的范围内变化,可以根据要分离物质分子 的大小,选择合适的凝胶成分,使之既有适宜的空隙度,又有比较好的机械性质。一 般说来,含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶,机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质,1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶,而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶,大孔胶易碎,小孔胶则难从管中取出,因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺,以改进凝胶的机械性能。
    ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明,易观察,可用检测仪直接测定。
    ④丙烯酰胺是比较纯的化合物,可以精制,减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体,甲撑双 丙烯酰胺称交联剂,在水溶液中,单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶。
  在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中,需要有催化剂参加,催化剂包括引发剂和 另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基,通过自由基的传递,使丙烯酰胺 成为自由基,发动聚合反应,加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表:
表 聚合反应催化剂配伍
引 发 剂  加 速 剂
(NH4)2S2O8  TEMED
(NH4)2S2O8 DMAPN
核 黄 素  TEMED
  注:(NH4)2S2O8,过硫酸胺 TEMED:N,N,N,N';四甲基乙二胺 DMAPN:β-二甲基胺基丙晴   用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应;用核黄素引发,需要强光照射反应液, 称光聚合反应。 聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响: 1、大气中氧能淬灭自由基,使聚合反应终止,所以在聚合过程中要使反应液与空气 隔绝。 2、某些材料如有机玻璃,能抑制聚合反应。 3、某些化学药物可以减慢反应速度,如赤血盐。 4、温度高聚合快,温度低聚合慢。 以上几点在制备凝胶时必须加以注意。 凝胶的筛孔,机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度,常用T%表达;凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度,常用C%表示。
  交联度过高,胶不透明并缺乏弹性;交联度过低,凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度,它不防止对流减低扩散的能力,而且因为它具有三 度空间网状结构,某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大 小和形状,这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用,这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物,因此,在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外,还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质(网孔的大小和形状等)。
  简单的计算是粗略的,与实际情况有一定距离,有人测定了总浓度(T)为20%的丙烯酰胺液,在六种不同比例的双丙烯酰胺存在 下,聚合后的网孔大小,发现孔径与总浓度有关,总浓度愈大,孔径相应变小,机械 强度增强,与总浓度不变时,甲叉双丙烯酰胺(Bis)的浓度在5%时孔径最小,高于或 低于此值时,聚合体孔径都相对变大,凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数,它 往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践,得到了如表3所示的经验值,在一般情况下,大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓 度的凝胶,所得电泳结果往往是满意的,因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝 胶”。
对那些用于重要研究的凝胶,最好是通过采用10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验,以选出最适凝胶浓度。
 
表 不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳 中所选用的凝胶浓度百分率
物 质 分子量范围 适用的凝胶浓度(%)
蛋白质 <10 1-4×104  4×10-1×105 1-5×105 >5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
核酸 <104 104-105 105-2×106 10-20 5-10 2-3.6
 
  聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类,前者指整个电泳系统中所用缓冲 液,pH值和凝胶网孔都是相同的,后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液,pH值和孔径,不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层,从而提高分辨 能力。
  蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,那电泳迁移率就取决于分子的大 小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇,SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量, 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别,SDS与蛋白质结合后,还可引起构象改 变,蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都不一样,约为18A,这样的蛋白质—SDS复合物,在凝胶中的迁移率,不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取决于分子量的大小,因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

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醋酸纤维素薄膜电泳编辑本段回目录

 醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体 有以下优点:①电泳后区带界限清晰;②通电时间较短(二十分钟至一小时);③它 对各种蛋白质(包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶)都几乎完全不吸附,因此无 拖尾现象;④对染料也没有吸附,因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完全 无色。它的电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素薄膜吸 水量较低,因此必需在密闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发。
  醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋 白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电 泳低,但它具有简单,快速等优点。根据样品理化性质,从提高电泳速度和分辨力出 发选择缓冲液的种类,pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强,对显色或紫 外光等观察区带没有影响,若样品含盐量较高时,宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白 电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液;氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸 盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做 上记号,点上样品,在一定的电压,电流下电泳一定时间,取下滤膜,进行染色。不 同物质需采用不同的显色方法,如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位,但许多 物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下,溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也 可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用光密度计测 定。它的缺点是厚度小,样品用量很小,不适于制备。

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琼脂糖凝胶电泳编辑本段回目录

在凝胶电泳中,首先应用的是琼脂电泳,它具有下列优点:(1)琼脂含液体量 大,可达98-99%,近似自由电泳,但是样品的扩散度比自由电泳小,对蛋白质的吸附 极微。(2)琼脂作为支持体有均匀,区带整齐,分辨率高,重复性好等优点。(3) 电泳速度快。(4)透明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪作定量测定。(5) 区带易染色,样品易回收,有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根,电渗作用大。 琼脂糖是从琼脂中提取出来的,是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖。含硫酸根比琼脂少,因而分离效果明显提高。
琼脂(糖)电泳常用缓冲液的pH在6-9之间,离子强度为0.02-0.05。离子强度过 高时,会有大量电流通过凝胶,因而产生热量,使凝胶的水份量蒸发,析出盐的结 晶,甚至可使凝胶断裂,电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变,可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液,混匀后再用。

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等电聚焦编辑本段回目录

等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质,当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度,当蛋白质放进此体系时,不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上,电聚焦的优点是:有很高的分辨率,可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开;一般电泳由于受扩散作用的影响,随着时间和所走的距离加长,区带越走越宽,而电聚焦能抵消扩散作用,使区带越走越窄;由于这种电聚焦作用,不管样品加在什么部位,都可聚焦到其电点,很稀的样品也可进行分离;可直接测出蛋白质的等电点,其精确度可达0.01pH单位。电聚焦技术的缺点是:一是电聚焦要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀,二 是样品中的成分必需停留于其等电点,不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。
  电聚焦技术要求有稳定的pH梯度,要求极防止对流和防止已分离区带再混合的措施,其办法有三:密度梯度,聚丙烯酰胺凝胶和区带对流聚焦,以第一种方法为常用。
一、基本原理
(1)人工pH梯度:在分离蛋白质时常用一个直立的性,以蔗糖密度梯度防止对流。当两个不同pH的缓冲液互相扩散时,在其混合区间即形成pH梯度,称为“人工pH梯度”。因为缓冲液是电解质,在电场中的它的离子移动会引起pH梯度的改变,所以不稳定。
(2)天然pH梯度:这种梯度是由电流本身所引起并保持的,比较稳定,其形成过程是,当电解硫酸钠的稀溶液时,在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。若将一些两性电解质放入槽中,则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电,在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电,这样就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质(甲),当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时,就会失去电荷而停止运动,(甲)所在的位置就是它的等电点,另有一个等电点稍高于(甲)的物质(乙),当向阳极运动靠近(甲)时,它不能超过(甲),因为那里低于它的等电点。于是(乙)将带正电荷而向阴极移动,它只能排要(甲)的阴极侧。假如有很多两性电解质,它们就会按照等电点由低到高的顺序依次排列,形成一个由阳极向阴极逐步升高的平稳的pH梯度,此梯度的进程取决于两性电解质的pH值,浓度和缓冲性质。防止对流的情况下,只要电流稳定,这个pH梯度将保持不变。
(3)两性电解质互相分离的条件:上述经验甲乙两物质形成两个相邻的不同pH的等电点层,因为在它们中间不能形成纯水层,所以它们不是完全分离开的,中间部分互相扩散,互相粘连。要使两物质完全分开,中间必须有一个介于其间pH值的物质,例如,当甲乙两物质的pH值正好一个在7以下,一个在7以上,即可以分开,因为中间形成了纯水层(pH=7),这时水是作为一个两性电解质而存在。
(4)蛋白质的电聚焦分离:蛋白质及多肽是两性电解质,它们比氨基酸更适于电聚焦,因为它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移,大部分中性氨基酸在接近等电点时就失去电荷而停止运动,不能过到真正的等电点。但在没有第三种居间的两性电解质存在时也不能将两种蛋白质完全分开,必须有很多不同pH值的是电解质(载体两性电解质)才能解决这个问题。
二、载体两性电解质
(1)载体两性电解质必需具备的条件:
(i)在等电点处必需有足够的缓冲能力,以便能控制pH梯度,而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。
(ii)在等电点必需的足够高电导,以便使一定的电流通过,而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数,使整个体系中的电导均匀,如果有局部电导过小,就会产生极大的电位降,从而其他部分电压就会太小,以致不能保持梯度,也不能使应聚焦的成分进行电迁移,达到聚焦。
(iii)分子量要小,便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。
(iv)化学组成应不同于被分离物质,不干扰测定。
(v)应不与分离物质反应或使之变性。总起来说,当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时,它在等电点的解离度大,缓冲能力强,而且电导系数高,这 就是好的载体两性电解质。
(2)理想的载体两性电解质的合成:
  用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺(如五乙烯六胺)为原料,与不饱和酸(如丙烯酸)发生加合反应:加合反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上,调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基,这种合成方法与一般有机会合成不同,有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好,而这里要求合成出的产物愈复杂愈好,要有多异构物和同系物,以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值,从而得到平滑的pH梯度。载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围,分子量在300-1000之间,它们的缓冲能力等于或优于组氨酸,电导性能良好,可以使电场强度分布较均匀,它们的水溶性良好,在1%水溶液中的紫外吸收值(260mμ)很低。
三、密度梯度等电点聚焦
(一)密度梯度
  密度梯度是用以防止对流保持pH梯度,避免已分离物质再混合的重要措施则由重溶液和轻溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶质应具有以下条件:溶解度高,粘度低;密度大,得到的密度差不低于0.12克/厘米3,不与样品蛋白质起反应,不解离。最常用的是蔗糖(分析纯),它对蛋白质不仅无害还有保护作用。重溶液含蔗糖50%(W/V),这时柱上和柱下最大密度差为0.2克/厘米3,浓度太高则粘度过大适用。蔗糖在高pH值时会分解,影响pH梯度及pI值测定,这种情况下可改用甘油,也可用甘露醇,山梨醇,右旋糖酐等。
(二)pH梯度的选择
  在测定未知蛋白时,可先采用pH3-10的载体,经初步测定后改用较窄的以提高分辨率,在使用pH7以上或以下范围时,因缺少中性载体,在聚焦过程中载体与电极之间在pH7部位就会形成纯水区带,纯水的电导极低,必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时,可加有机酸如一氯醋酸,二氯醋酸,甲酸,乙酸,pH离于10时,可补加胺使pH增加到11。载体在pH6附近电导较低,可以与蔗糖密度梯度互相补偿,蔗糖浓度高时电导低,所以可把pH6电导低部位放在柱上部,也就是用pH6以下范围时,阴极在上,而用pH6以上范围时,阳极在上方。
(三)蛋白质样品及分离容量
  电聚焦有高的分辨力,一般样品不需提纯,分析上可用来测定混合物中某一成分的相对比例:如大量提纯蛋白质,则应预先初步提纯。有些物质(如核酸)聚焦时会沉淀,应预先除去。蛋白质应不含盐,因盐浓度高电流大,易发热,而且盐离子迁移至两极产生酸碱,占据了分离的有效部位。加样体积不受限制,最高可达80-85毫升。   等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响:聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯度所能支持的蛋白质,提高密度可以提高分离容量;容量与区带高度的平方成正比,降低电压可使区带变宽,提高容量,但分辨率降低,聚焦时间长,用窄的pH梯长范围可以使区带变宽,提高分辨率。用110毫升柱时,每一区带蛋白质含量最高可达20-25毫克,由于粗蛋白样品可分为很多区带,所以总量可以加至几百毫克;分离的容量与柱的横载面成正比,用440毫克柱时,可加粗蛋白质5克,每一区带可达一克。

 

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