手足口病（Hand,footandmouthdisease,HFMD）是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）最为常见。

潜伏期
　　该病的潜伏期为2～7天，传染源包括患者和隐性感染者。流行期间，患者为主要传染源。患者在发病急性期可自咽部排出病毒；疱疹液中含大量病毒，破溃时病毒溢出；病后数周，患者仍可自从粪便中排出病毒。

传染源
　　手足口病的传染源是患者和隐性感染者。流行期间，患者是主要传染源。患者在发病1～2周自咽部排出病毒，约3～5周从粪便中排出病毒，疱疹液中含大量病毒，破溃时病毒即溢出。带毒者和轻型散发病例是流行间歇和流行期的主要传染源。

传播方式
　　该病传播方式多样，以通过人群密切接触传播为主。病毒可通过唾液、疱疹液、粪便等污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具以及床上用品、内衣等引起间接接触传播；患者咽喉分泌物及唾液中的病毒可通过飞沫传播；如接触被病毒污染的水源，亦可经水感染；门诊交叉感染和口腔器械消毒不合格亦是造成传播的原因之一。

易感人群
　　人群对引起手足口病的肠道病毒普遍易感，感染后可获得免疫力。由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保护力，因此，人群可反复感染发病成人大多已通过隐性感染获得相应抗体，因此，手足口病的患者主要为学龄前儿童，尤以≤3岁年龄组发病率最高。据国外文献报道，每隔2～3年在人群中可流行一次。

流行方式
　　手足口病分布极广泛，无严格地区性。四季均可发病，以夏秋季多见，冬季的发病较为少见。本病常呈暴发流行后散在发生，该病流行期间，幼儿园和托儿所易发生集体感染。家庭也有此类发病集聚现象。医院门诊的交叉感染和口腔器械消毒不严格，也可造成传播。天津市两次较大流行，托幼单位儿童发病率明显高于散居儿童。家庭散发，常一家一例；家庭暴发，一家多人或小孩子与成人全部感染发病。此病传染性强，传播途径复杂，流行强度大，传播快，在短时间内即可造成大流行。

临床特征
　　急性起病，发热；口腔粘膜出现散在疱疹，米粒大小，疼痛明显；手掌或脚掌部出现米粒大小疱疹，臀部或膝盖偶可受累。疱疹周围有炎性红晕，疱内液体较少。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐、头疼等症状。该病为自限性疾病，多数预后良好，不留后遗症。极少数患儿可引起脑膜炎、脑炎、心肌炎、弛缓性麻痹、肺水肿等严重并发症。

诊断
　　手足口病只是可引起口腔溃疡的许多种传染病中的一种，另一种常见的口腔溃疡的原因是口腔疱疹病毒感染，它使口腔和牙龈产生炎症（有时称口炎）。

　　医生通常能根据病人的年龄、病人或家长的诉说的症状，及检查皮疹和溃疡来鉴别手足口病和其他原因所致的口腔溃疡。可将咽拭子或粪便标本送至实验室检测病毒，但病毒检测需要2－4周才能出结果，因此医生通常不提出做此项检查。

主要诊断依据
　　流行病学资料、临床表现、实验室检查、确诊时须有病原学的检查依据。

　　1、好发于夏秋季节；

　　2、以儿童为主要发病对象，常在婴幼儿集聚的场所发生，呈流行趋势。

　　3、临床主要表现为初起发热，白细胞总数轻度升高，继而口腔、手、足等部位粘膜、皮肤出现斑丘疹及疱疹样损害。

　　4、病程较短，多在一周内痊愈。

鉴别
　　本病主要诊断依据

　　①好发于夏秋季节。

　　②以儿童为主要发病对象，常在婴幼儿集聚的场所发生，呈流行趋势。

　　③临床主要表现为初起发热，白细胞总数轻度升高，继之口腔、手、足等部位粘膜、皮肤出现斑丘疹及疱疹样损害。

　　④病程经过较短，多在一周内痊愈。根据上述临床特征，在大规模流行时，诊断不困难。但散在发生时，须与口蹄疫、疱疹性咽颊炎、风疹等鉴别：

　　(1)口蹄疫由口蹄疫病毒引起，目前有7个血清型、65个亚型。主要侵犯猪、牛、马等家畜。对人虽然可致病，但不敏感。一般发生于畜牧区，成人牧民多见，四季均有。口腔粘膜疹易融合成较大溃疡，手背及指、趾间有疹子，有痒痛感。

　　(2)疱疹性口炎四季均可发病，以散在为主。一般无皮疹，偶尔在下腹部可出现疱疹。

　　(3)疱疹性咽颊炎，可由CoxA组病毒引起，病变在口腔后部;如扁桃体、软腭、悬雍垂，很少累及颊粘膜、舌、龈。不典型、散在性HFMD很难与出疹发热性疾病鉴别，须做病原学及血清检查。

预防

　　本病主要通过食物、口鼻飞沫及接触传播，因此预防上主主要应做到

　　1．注意饮食卫生，避免病从口入；

　　2．避免与患儿接触，幼托机构发现病人，要采取隔离措施；

　　3．平时应加强体质锻炼；

　　4．调理脾胃，及早治疗食积。

　　（一）加强监测，提高监测敏感性是控制本病流行的关键。及时采集合格标本，明确病原学诊断；

　　（二）做好疫情报告，及时发现病人，积极采取预防措施，防止疾病蔓延扩散；

　　（三）托幼机构做好晨间体检，发现疑似病人，及时隔离治疗；

　　（四）被污染的日用品及食具等应消毒，患儿粪便及排泄物用3％漂白粉澄清液浸泡，衣物置阳光下暴晒，室内保持通风换气；

　　（五）流行时,做好环境、食品卫生和个人卫生；

　　（六）饭前便后要洗手，预防病从口入；

　　（七）家长尽量少让孩子到拥挤公共场所，减少被感染机会；

　　（八）注意婴幼儿的营养、休息，避免日光曝晒,防止过度疲劳，降低机体抵抗力；

　　（九）医院加强预诊，设立专门诊室，严防交叉感染。

国际疫情
　　手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有流行报导。1957年新西兰首次报导该病，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出“手足口病”命名。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。

　　日本是手足口病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行，1969～1970年的流行以CoxA16感染为主，1973和1978年的2次流行则由EV71引起，1997～2000年手足口病在日本再度活跃，EV71、CoxA16病毒均有分离。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4～8月共有2628例发病，仅4～6月就有29例病人死亡，死者平均年龄1.5岁。1998年我国台湾省发生EV71引起的手足口病和疱疹性咽峡炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129106例，重症病人405例，死亡78例，死亡病例大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎等。

我国疫情
　　我国自1981年在上海发现本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东等十几个省（市）均有报导。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发流行，5～10月间发生了7000余病例；经过2年散发流行后，1986年又出现了以托儿所及幼儿园为主的暴发。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71病毒，1998年深圳市卫生防疫站从患者分离出2株EV71病毒。2000年5～8月山东省招远市小儿手足口病暴发，市人民医院接诊患儿1698例，其中男1025例，女673例，年龄最小5个月，最大14岁；3例合并暴发心肌炎死亡。

　　2006年，全国共报告手足口病13637例（男性8460例，占62.04%；女性5177例，占37.96%），死亡6例（男性4例，女性2例）。除西藏自治区外，全国31个省、自治区、直辖市均有病例报告。报告发病数居前十位的省份依次为山东（3030例）、上海（2883例）、北京（2210例）、河北（1133例）、浙江（793例）、广东（670例）、黑龙江（576例）、四川（335例）、江苏（287例）和福建（240例）。

　　截止2007年5月21日，2007年全国共报告手足口病5459例，死亡2例。与去年同期(2488例)相比，报告病例数上升119.41%。

　　从近年报告的疫情资料来看，手足口病每年的发病时间高峰位于7月份左右。由于2007年全国气温上升较早，专家预测，可能导致手足口病发病高峰提前，2007年全国手足口病报告病例数将进一步增加。2008年4月于安徽省阜阳市爆发。四日零时到五日零时，阜阳市新增报告手足口病病例三百九十八例，其中住院两百五十三例，比上日减少五十五例。当日出院一百六十八例，无死亡病例。目前仍住院治疗的一千三百一十四例，其中危、重症病例比上日减少十一例。

　　据悉，至今安徽省已经治愈两千六百四十二例，其中治愈重症、病危患者九十四例。

　　进入2008年后，手足口病呈蔓延趋势。
　　截至2008年5月7日，广东全省共报告手足口病病例4876例，死亡3例。近三日均无新发生的死亡病例报告。广东省对临床诊断怀疑为EV 71手足口病的191例病例标本进行了实验室检测，结果EV71核酸阳性只有33例，当中包含此前报告的佛山高明2例死亡病例，其他绝大多数患者病情平稳。
　　从2008年1月1日至5月6日，天津市累计报告手足口病病例134例(发病率为1.28/10万)，其中本市病例128例，外地病例6例，没有重症入院和死亡病例。

来源：卫生部发布的手足口病预防控制指南（2008年版）

为规范手足口病的标本采集、运送及实验室检测操作程序，提高检测准确性，从而为手足口病的明确诊断和相关实验研究提供可靠的依据，特制定本方案。

手足口病的实验室检测原则和程序
手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断（见下图：手足口病的实验室诊断流程图）。
一般是由省级病毒实验室进行病毒的分离，爆发疫情范围较大时，国家参比实验室也可以提供技术支持。病毒分离成功后，送至国家参比实验室进行鉴定或复核，同时对全国手足口病的病原进行病毒学监测。国家参比实验室接到标本后，在30日内将结果反馈给省级实验室。
很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD细胞（对CA16和EV71敏感）、HEp-2细胞（对某些柯萨奇B组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如Vero细胞）有助于分离到更多的肠道病毒。
使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验是肠道病毒鉴定的基本方法，如果使用了适当的抗血清，实验结果是比较可靠的。因为肠道病毒包括若干个血清型，通常使用组合抗血清进行鉴定，有些组合抗血清已经商品化。
当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。一般用急性期血清与恢复期血清的检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证明有急性感染。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。
为了提高检测速度，也为了辅助中和实验法进行毒株鉴定，最近很多实验室都使用分子生物学方法。目前，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一的标准，而且要根据检测目的选择使用适用的方法。

检测结果的评价
如果从临床标本中分离到肠道病毒，尤其是分离自脑脊液、疱疹液，那么很可能该病毒就是病因病原。当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。对于难以分离到的肠道病毒，分子生物学方法如RT-PCR是很有用的。肠道病毒有时引起无症状感染，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。

实验室诊断标准
根据手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD临床诊断，流行病学接触史有助于诊断，临床诊断病例中符合下列之一，即为实验室诊断病例：
1，患者的粪便标本、咽拭子标本中病毒分离阳性率远高于对照人群；
2，肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256；或恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体较急性期有4倍或4倍以上增高；
3，在病变组织中如疱疹液或脑脊液中分离到病毒；
4，自患者血清、疱疹液或脑脊液等标本中检测到病原体核酸。
 
 
一、标本采集对象
标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构的5岁以下的儿童（作为健康对照人群）。
用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在0~8℃运输和保存。标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。
二、标本种类及采集、运送
（一）粪便标本
采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（二）咽拭子标本
采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（三）血清标本
采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。
（四）疱疹液
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（五）脑脊液标本
出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（六）病例密切接触者的标本采集
选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。
（七）健康对照的标本采集
选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。
三、标本采集注意事项
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值，但对于不同血清型的肠道病毒，脑脊液中的病毒分离率是大不相同的。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。
四、实验室检测操作流程
（一）病毒分离
1.试剂配置
（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表
 生长液（GM） 维持液（MM）
Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml
L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml
胎牛血清 10.0ml 2.0ml
7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml
P.S溶液*(青霉素及链霉素) 1.0ml 1.0ml
（2）粪便标本的处理液
完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ ml。
2．病毒分离细胞系
许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CA16）生长。
对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CA16的标本均需接种到以下两种细胞系：
 RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。
 HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。
3．标本的处理
（1）粪便标本的处理
操作步骤：
1.1在离心管上标记标本号；
1.2每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；
1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；
1.4剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；
1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；
1.6在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；
1.7在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）；
1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备接种。
（2）疱疹液标本的处理
疱疹液标本通常直接用于病毒分离。
（3）脑脊液标本的处理
脑脊液标本通常直接用于病毒分离。
（4）咽拭子标本的处理
咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
4．接种和观察（病毒分离）
（1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成；
（2）倒掉生长液（GM），换上1~1.2ml的维持液（MM）；
（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；
（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；
（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本的病毒分离，尤其是EV70的分离培养，强烈建议降低培养温度，一般可为34~35℃）；
（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；
（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+~4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%）；
（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代。同一病例的二次传代的病毒分离物可以放到一起用于进一步的鉴定；
（9）第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；
（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定。
（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；
（12）盲传2代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；
（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应。
（14）几个概念：
   A：毒性反应：如果在接种后1~2d内细胞快速地调亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。
   B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。
   C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7~10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。
5．病毒分离结果解释：
RD细胞支持HFMD的主要病原体——CA16和EV71的复制，CA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。
若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其它可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。
从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。
（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度
比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。
作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清（或脑脊液）中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，不明显的肠道病毒感染（隐性感染）也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CA16原型株为G-10株），有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。
使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清（CSF）中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，当然，分离株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先测定。
中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现致细胞病变效应（CPE），特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。
1．液体配制
A液：血清处理液：（100ml中含下列液体）
         MEM          85ml
         3% L-谷氨酰胺       1ml
         7.5%碳酸氢钠       2ml
         胎牛血清         2ml
         青、链霉素（各10000U/ml）    10ml

B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列液体）
         MEM          85ml
         3% L-谷氨酰胺       1ml
         7.5%碳酸氢钠       2ml
         HEPES         1ml
         胎牛血清         10ml
         青、链霉素（各10000U/ml）    1ml
      C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）
         MEM          93ml
         3% L-谷氨酰胺       1ml
         7.5%碳酸氢钠       2ml
         HEPES         1ml
         胎牛血清         2ml
         青、链霉素（各10000U/ml）    1ml
2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备
（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余者应废弃；
（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；
（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；
（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID50；
log CCID50 = L-d (S -0.5 )，其中：
L = 实验中使用的最低稀释度的log值；
d = 稀释梯度的log值；
S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。
（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2~3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒载量；
（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；
（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；
（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即10 CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。
3．稀释血清
（1）发病1~3d内采取患者急性期血清，发病后2~4周采取恢复期血清，分别－20℃冻存备检。
（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。
（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8~10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。
（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。
4．病毒中和抗体测定的操作步骤：
（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清0.05ml，不必换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；
（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；
（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；
（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；
（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；
（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育培养；
（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；
（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。
5．结果判定：
当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。
对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。
（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
1．RNA提取
可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；
（1），向一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液（含Carrier RNA）；
（2），再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s；
（3），室温下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬时离心；
（4），加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心；
（5），小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中（试剂盒附带），将QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（6），弃去收集管中的液体，重复第6步骤；
（7），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（8），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（9），弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1min；
（10），将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；
（11），向膜上加入40μl的EB缓冲液，然后室温下静置2~5min；
（12），在离心机中以8000 rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。
2．RT-PCR扩增
（1）引物序列合成
1）人肠道病毒（包括EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
3）CA16核酸检测引物序列：
Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
（2）实验设计
1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。
2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
A：阳性对照：无感染性的对照RNA。
B：细胞对照：使用未接种病毒的细胞悬液，最好使用与扩增病毒所用的细胞类型与代数相同的细胞。每一次实验设2个细胞对照。
C：试剂对照：用去离子水代替标本。
（3）RT-PCR扩增
    1）在冰面上融化病毒标本和各种PCR试剂；
    2）配下列试剂主溶液：
10×PCR Buffer•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5.0μl
dNTPs（2.5mM each）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2.0μl
上游引物（0.1μg/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
下游引物（0.1μg/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）••••••••••••••••••••••••••••••••••••••0.5μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••0.5μl
AMV逆转录酶（10U/μl）••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
模板RNA••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3.0μl
RNase Free dH2O•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36.0μl
     50.0μl
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
42℃••••••••••••••••••••••••45min
95℃••••••••••••••••••••••••3min
95℃••••••••••••••••••••••••20s
45℃••••••••••••••••••••••••25s    ×32个循环
72℃••••••••••••••••••••••••30s
72℃••••••••••••••••••••••••10min
 4℃••••••••••••••••••••••••Soak
3．电泳分析
1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；
2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；
4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35~40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；
6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，——注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用；
7）在蒸馏水中涮一下凝胶；
8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。
4．结果解释
通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
RT-PCR实验结果解释表
待检标本RT-PCR结果 鉴定结果
所有引物（－） 非肠道病毒（NEV）
EV（＋），EV71（－），CA16（－） 非EV71、CA16的其它肠道病毒
EV（＋），EV71（＋），CA16（－） EV71
EV（＋），EV71（－），CA16（＋） CA16
五、生物安全
根据2006年1月11日卫生部制订的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。
操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。
灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。
所有操作应遵守国家相关法律法规。

典型病例一
       一、一般情况和流行病学
       患儿，男，14月，外来打工子女，暂住农村出租房，环境拥挤，由其母自带，未能按时预防接种，平时身体健康。
       二、发病后就诊情况
       患儿于2008年4月19日（病程第一天）发热（具体不详），精神佳，未能引起家长重视。于病后第三天因体温无明显下降、胃纳减退到当地卫生院就诊,测体温38.5℃,查血常规：WBC19.2×109/ N70％ L 29% PLT272×109/L。予以头孢呋辛 0.75、更昔洛韦50mg静脉滴注2天，病后第五天因体温下降不明显（波动于38—38.5℃）而于2008年4月22日到省级医院就诊。门诊查体：神清，能独立行走，体温38.2，呼吸平，咽红，咽周可见数枚疱疹，心肺听诊无殊。血常规：WBC17.2×109/ L/ N75％ 、L 32%、 PLT278×109/L，C反应蛋白：10mg/L 。未行胸部X线检查，予以氯唑西林1.0，利巴韦林0.1静脉滴注，在门诊输液中（约3 小时后）出现呕吐2次，吐出胃内容物，脸色苍白，口唇紫绀，呻吟，由输液室护士急送急诊抢救室。查体：神志清，烦躁不安，四肢末偏冷，可见花斑，血气分析：PH7.261、 PaO276.6mmHg、 PaCO248.mmHg、BE-11.3mol/L Lac:6.9mol/L,血氧饱和度（SPO2）60%，予以头罩吸氧下不能维持正常SPO2，立即予以生理盐水100ml扩容，气管插管，（气管内有较多淡红色泡沫液）人工呼吸机应用，急诊以疱疹性咽炎、重症肺炎、感染性休克、呼吸循环衰竭收住PICU。
       三、临床症状和体征
       患儿以发热为主要表现，体温波动于38—38.5℃，精神佳，能自行独走。病后无咳嗽，无腹泻、无抽搐。于病后第五天到省级医院就诊时，查体：神清，能自行独走，体温38.2℃，呼吸平，咽红，咽周可见数枚疱疹。两肺呼吸音清，心率：110次/分，律齐，音响，手、足、臀部未见皮疹。时隔3小时后在输液期间出现呕吐，面色苍白，口唇发绀，呻吟，入急诊抢救室查体：神清，烦躁不安，面色苍白，口唇紫绀，呻吟。体温36.1℃ 呼吸56次/分 血压105/68mmHg SpO260%，两肺闻及大量水泡音，心率156次/分，律齐，心音偏低，肝肋下1.5CM，四肢末偏冷，可见花斑，颈软，双侧巴氏征阴性，皮肤未见皮疹。入抢救室约半小时后出现神志不清。入院查体：神志不清，体温36.1℃ 血压78/48mmHg 双侧瞳孔2.5mm，对称，光反射迟钝，两肺呼吸音对称，可闻及大量湿性罗音，心率180次/分，律齐，心音低，肝肋下1.5CM，双侧巴氏征阴性。昏迷评分：4分。
       四、实验室检查
       （一）外周血常规及C反应蛋白（CRP） 
       （二）大便常规
       4月25日：大便OB 阴性。 4月25日：大便EV71(PCR)法阳性。
       （三）血液检查
       病程第6天、 PT+APTT：正常。
       4月23日 血清病原体（G+和G-）DNA测定：阴性。
       4月25日 血清病原体测定显示：肺炎支原体阴性，沙眼衣原体阴性，肺炎衣原体阴性。
       （四）血气分析 
       五、病原学检测
       （一）呼吸道分泌物病原学检测
       病程第5天：（免疫荧光法）：腺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒抗体均阴性。
       （二）EV71检测
       病程第六天省疾病预防与控制中心（CDC）应用聚合酶链反应（real—time PCR）技术检测血及大便标本EV71病毒核酸,2008年4月26日CDC报告,大便EV71阳性，血标本阴性。
       六、胸部影像学
      病后第五天（入院当天）床边X线胸片示：两肺弥漫性分布片状模糊影，右肺大片实变影伴左肺透亮度增高。
       病程第六天（入院第二天）两肺透亮度减低，右侧胸腔积液。
       病程第七天（入院第三天）两肺透亮度进一步减低，可见支气管充气，双侧胸腔积液，胸壁软组织肿胀。 
       七、心电图和腹部B超
       病程第7天心电图显示：非阵发性交界性心动过速，不完全性右束支传导阻滞。
       病程第8天心电图显示：窦性心动过速，ST段改变。腹部B超：胆囊壁水肿，双肾回声增强，双肾肾周少量积液。腹腔积液，双侧胸腔积液。
       八、住院经过和病情转归
         患儿入院后诊断： 疱疹性咽炎，重症肺炎，呼吸循环衰竭，感染性休克？过敏性休克？病毒性脑炎？在持续人工呼吸机应用下（模式：BiPAP，PIP/PEEP： 35/10cmH2O，潮气量：8ml/kg，呼吸频率：30次/分，吸入氧浓度：99%）以维持PH、PaO2、PaCO2在正常范围内。血气分析显示代谢性酸中毒明显，予碳酸氢钠纠酸。
       1、白蛋白1g/kg q12h，甘露醇1g/kg q6h及输注血浆以降低颅内压和扩容，实行“边补边脱”原则。
       2、予以甲基强的松龙7.5mg/kg q12h,静脉丙球1g/kg qd，抑制炎症介质释放和增加机体免疫功能，加强机体抗菌抗病毒能力。
       3、头孢曲松40mg/KG静脉推注q12h抗感染。
       4、考虑脑干受累予纳洛酮0.03mg/kg qd 静脉滴注。
       5、多巴胺、多巴酚丁胺10ug/kg•min， 肾上腺素0.1ug/kg•min泵维持以增加心脏的收缩功能及肾血流量，改善循环。
       6、维持水电解质平衡。
       7、由于血糖高达32mmol/L，予以胰岛素0.1ug/kg•h维持并根据血糖监测情况调整速度。
       经18小时治疗后（入院第2天），血糖波动于18～26mol/L。X线胸片示：肺水肿与前片相仿，胸腔积液增加，肝功能肾功能示正常，CRP:69mg/L，血压波动50～70/40～60mmHg，体温最高达39.5℃，神志不清，双侧瞳孔散大，对光反射消失，压眶反射未引出，两肺闻及较多湿性罗音。心率波动于160～180次/分，率齐，心音低，肝脏肋下1.5cm，SaO292～95％，血气分析示代谢性酸中毒，并出现心跳骤停一次，经复苏后加大肾上腺素量至0.2ug/kg•min.，多巴胺、多巴酚丁胺增加到15 ug/kg•min泵维持。头部冰袋使用并给予变温毯。抗生素停头孢曲松改美平20mg/kg q8h 静脉滴注，并继续使用静脉丙球，甲基强的松龙、输血浆、白蛋白、及甘露醇，加强液体管理及支持疗法等措施。入院第3天，神志不请，无自主呼吸，双侧瞳孔散大，体温波动于35～38℃，血压维持在105～80/50～70mmHg， SaO295～98％，心率130～140次/分，肝肋下2.0cm，肝功能：ALT 2289u/L，血糖正常，肾功能：Cr正常。心电图提示非阵发性交界性心动过速，不完全性右束支传导阻滞。X线示肺部改变与前片相仿，右侧胸腔积液有所减少。腹部B超示：胆囊壁水肿，双肾回声增强，双肾肾周少量积液。呼吸机条件不变，停用胰岛素，加用护肝药，继用甲基强的松龙及甘露醇，维持水电解质平衡。 入院第4天心电图示：窦性心率，ST波改变，8：30am左右突然出现心跳骤停一次，血压突然下降，患儿血气分析PH值进行性下降，最低降至6.990，胸片示两肺透亮度进一步降低，可见支气管充气，，双侧胸腔积液，肝功能示ALT ：2194IU/L，肾功能Cr171 umol/L，血氨197 umol/L，患儿于2008年4月25日9时55分死亡（发病第八天）。
       九、经验总结
      （一）临床特点
      ①患儿为14月龄儿童，外地误工子女。②以发热，咽周疱疹起病，病后第三天开始用抗生素等药物治疗。③来院体征仅发现咽周疱疹，体温38.2℃。输液过程中出现呼吸急促、发绀、呻吟、颜面苍白。④实验室检查：白细胞增高，CRP偏高，持续人工呼吸机应用下肺部湿性罗因明显，X线影像示肺部水肿体征无明显改善，并出现ARDS症，血压波动明显，神志无改善，肝功能、肾功能、血氨增高。反复出现心跳骤停。血气分析显示进行性加重的代谢性酸中毒。
       根据以上情况可以看到，患儿以发热、咽周疱疹起病，到病程第五天在输液中出现病情急剧变化，以呼吸循环衰竭及神经系统损害为主。应考虑①除引起疱疹性咽炎的常见病毒如柯萨奇病毒可引起的多脏器损伤外，还应考虑由于EV71感染所致。②输液反应或药物导致的过敏性休克。③在病毒感染的基础上，继发感染所致感染性休克。
       此外，需要与下列疾病进一步鉴别：1、重症肺炎：患儿有呼吸衰竭，X线显示肺部有斑片状阴影，同时有中枢、循环系统损害等表现，但患儿病情变化如此之快，很快出现肺水肿，不能用单独的重症肺炎来解释。2 、颅内感染：患儿有发热、咽部疱疹病史，病程第4天出现昏迷，入院后昏迷评分4分，故不能排除颅内感染，尤其是与咽部疱疹相关的病毒性脑炎。在病情允许时可行腰穿脑脊液检查排除化脓性脑膜脑炎。3、败血症、感染性休克：患儿有发热4天病史，辅助检查显示白细胞增高，C反应蛋白增高，乳酸增高，X线显示肺部有斑片状阴影，同时有呼吸、循环衰竭表现，但整个病情突然进展，与病情发展变化规律不甚符合。4、过敏性休克：患儿在输液过程中突然出现呼吸困难，心率明显增快，两肺湿性罗音，故不能排除由于药物过敏或输液反应所致的休克。5、肠道病毒71型感染：患儿在疱疹性咽炎病程第4天突然出现呼吸、循环衰竭、神经系统损害，应考虑近年来国外关注较多的肠道病毒71型感染。该病毒通过肠道黏膜侵入后形成病毒血症，然后病毒通过循环系统侵入机体各器官如皮肤、心脏、肺、中枢、肾上腺等，尤其是对中枢损害可能会导致交感－肾上腺髓质系统持续兴奋，肺组织中肾上腺素受体活性增强，介导肺血管收缩引起肺血管静水压升高，同时血管内皮细胞损伤和细胞炎症介质释放，导致毛细血管通透性增加，即通常说的神经源性肺水肿。因此，应与疾病预防与控制中心联系检测EV71以明确诊断。若明确为EV71感染所致，则患者预后极差。
       （二）诊断和治疗体会
       ①患儿在发病初无特异的临床表现，早期识别困难。②对仅有咽周疱疹或手、足、口疱疹、且发热持续2—3天以上患儿应予留院观察治疗，并进行X线胸片、心电图、血糖等常规检查，进行必要的排查。③从发病后第五天，病情发生急剧变化，不能仅考虑有输液反应，药物过敏引起休克，同时应考虑病情本身特殊变化。④从发病到死亡共八天，说明一旦病情恶化，病人出现呼吸循环衰竭，治疗困难。因此强调早期诊断，早期治疗。

典型病例二
       一、一般状况和流行病学
       患儿男，2岁，为外来打工者子女，病前居住在农村出租房，其奶奶一周前曾经到手足口病发病率较高的地区。患儿由其奶奶照管。平素易感冒。
       二、发病后就诊状况
       患儿于因2008年5月10日因发现发热、手心、脚掌心有皮疹1天来院门诊。体温波动于38℃～38.6℃，精神佳。无咳嗽，无腹泻，无抽搐。曾予以口服退热药，但效果不佳。因体温不退，胃纳欠佳就诊。以手足口病留院观察。予头孢曲松，利巴韦林，维生素C治疗，甘露醇q8h应用。留观第2天，出现嗜睡伴呕吐，呼吸不规则，双眼凝视，以手足口病伴脑干脑炎收入院。
       三、临床症状和体征
       病初仅表现发热伴皮疹以手心、脚掌皮疹，留观查体：体温39.4℃，呼吸30次/分，脉搏144次/分，血压90/60mmHg，神清，精神软，咽红，咽部未见疱疹，两肺及心脏听诊无殊，腹软，肝肋下1.0cm，双手掌、脚掌可见散在皮疹，基底略红上有水泡，渗液浑浊，无触痛，颈软，双侧巴氏征阴性。留观期间进食后呕吐胃内容物2次，非喷射性。查体：体温波动于39～40℃，精神软，嗜睡，呼吸欠规则，偶可见潮式呼吸。双眼时有凝视，持续数秒钟，无四肢抽搐。两肺呼吸音粗，心率150次/分，律齐，音响，腹软，肝脏肋下1.0cm，颈部抵抗，左侧巴氏征阳性。
       四、实验室检查
       门诊血常规：白细胞12.6×109/L，中性粒细胞58.6％，淋巴细胞41％，血小板400×109/L，C反应蛋白6mg/L。
       病程发热第二天C反应蛋白24.4mg/L，血糖正常，血气分析和肝肾功能正常。
       脑脊液常规：检查： 潘氏阴性，有核细胞 15个/mm3。
       五、病原学检测
       （一）咽拭子
       病程第3天，在消毒试管加1ml生理盐水，并用消毒棉签（湿）在咽后壁用力拭抹后放入采样试管内，旋紧管盖，在4℃条件下CDC，检测EV71, 柯萨奇病毒A16.5月14日结果报告均为阴性。
       （二）大便
       取大便5～8g放入无菌采样管，在4℃条件下送市CDC，检测EV71。5月14日结果报告为阴性。
       六、肺部影像学检查
       病程第2天，X线胸片示：两肺可见小斑片状影。头颅CT示脑沟变宽。
       病程第3、4天：X线胸片示：两肺纹理增粗。
       七、经过和病情转归
       患儿留院观察时初步诊断为手足口病。留观期间体温持续上升，波动于39.4～40℃，并出现嗜睡，呼吸欠规则，时有双眼凝视。颈部抵抗，左侧巴氏征阳性。复查C反应蛋白24.4mg/L。胸片提示：两肺可见斑片状影。腰穿脑脊液常规检查： 潘氏阴性，有核细胞 15个/mm3 。头颅CT示脑沟变宽。予头孢曲松 70mg/kg,维生素Ｃ1.0，利巴韦林 10mg/kg,甘露醇 1g/kg q8h, 静脉丙球400mg/kg，甲基强的松龙2mg/kg，qd 静脉应用。
       考虑有多脏器损害存在。2008年5月11日请专家会诊，诊断为足口病并发脑干脑炎、支气管肺炎予住院治疗。
       住院后予面罩吸氧，甘露醇 1g/kg q6h，并增加白蛋白1g/kg q12h，速尿1g/kg q12h以脱水降低颅压。 改静脉丙球1.0 g/kg qd，甲基强的松龙7.5mg/kg，q12h 静脉应用，纳洛酮0.03mg/kg。住院当天，体温波动于39～40℃。精神软，嗜睡，呼吸欠规则，可见呼吸暂停，口唇发绀，双侧瞳孔等大，光反射存在，颈抵抗，两肺未及罗音，心率156次/分，律齐，音响，肝肋下3cm，左侧巴氏征阳性。血气分析示：PH 7.294，PaO2 65.5mmHg，PaCO2 61.9mmHg。面罩吸氧下 SaO2小于90%，予气管插管人工呼吸支持。在人工呼吸机（模式 BIPAP）应用下，潮气量100ml(8ml/kg),呼吸频率 30次/分，吸入氧浓度60%，PIP/PEEP17/3 cmH2O ，患儿维持血氧饱和度99%（吸入氧浓度逐渐下降至30%），有创血压监测90～115/50～70 mmHg，体温有所下降，血糖检测7.0～8.1mmol/L，心电监护仪显示心率150～160次/分，伴有窦性心率不齐，无自主呼吸，双侧瞳孔2.0mm，光反射迟钝，血气分析各项指标在正常范围。住院后第2天，持续人工呼吸支持下神智不清，无自主呼吸，体温波动于37～38℃，血压正常，双侧瞳孔2.5mm，光反射迟钝，两肺未及罗音，心率140～150次/分，律齐，音响，肝肋下4cm，四肢末端温。加用多巴胺、多巴酚丁胺5 ug/kg.min静脉泵维持，检测血糖3.8～5.1mmol/L，肝肾功能和血气分析正常。
       入院第3天，患儿出现自主呼吸5～6次/分，呼吸机模式改成SIMV，呼吸频率15～25次/分，其他条件不变。查体：压眶反射引出，双侧瞳孔等大，对光反射较前敏感，肝脏肋下3.0cm。胸片显示肺部纹理增粗，血糖 6.3mmol/L，停静脉丙球。入院第四天，神志转清，自主呼吸20～30次/分，患儿体温正常，两肺呼吸音清晰，心脏听诊正常，肝脏肋下2.5cm，予撤离呼吸机改为温湿化面罩吸氧，停多巴胺、多巴酚丁胺，改甲基强的松龙1mg/kg，q12h 静脉应用，停纳洛酮静脉应用。
       入院第五天，呼吸40～50次/分，较浅，规则，无明显发绀，心率130～140次/分，肝脏肋下2.5cm，四肢末端温，尿量多。患儿病情逐渐恢复，开始进食。
       八、病例总结
      （一）临床特点
      ①患儿为2岁男性，为打工者子女，居住条件拥挤。其奶奶一周前曾经到手足口病发病率较高的地区。②以发热、手脚掌心皮疹就诊，皮疹基底略红上有水泡，无触痛；③病后出现体温持续升高，呼吸不规则暂停，呕吐，双眼凝视，神智不清，双侧瞳孔光反射迟钝，颈部抵抗，双侧巴氏征阳性。肝脏进行性增大等多系统损害表现。④ 实验室检查 白细胞增高，C反应蛋白增高，血糖一过性增高。胸片示：两肺可见斑片状影。血气分析提示低氧血症、高碳酸血症。头颅CT示脑沟变宽。腰穿脑脊液常规检查： 潘氏阴性，有核细胞 15个/mm3 。
       根据临床表现结合实验室检查， 手足口病并发脑干脑炎诊断成立。在病原学上不能排除EV71感染。 EV71通过肠道黏膜侵入后形成病毒血症，然后病毒通过循环系统侵入机体各器官如皮肤、心脏、肺、中枢、肾上腺等，尤其是中枢神经系统累及时。组织炎症较神经毒性更强烈，在脑干、大脑等部位的局部脑组织中除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症，形成无菌性脑炎。
       在鉴别诊断中应考虑在鉴别诊断上需考虑：①乙脑 患儿有持续高热病史，血常规中性粒细胞分类偏高，C反应蛋白逐渐升高，病程第二天出现精神、神经系统改变，呼吸不规则等，与乙脑有相似之处。但该病有较明显的季节性，同时患儿有手足口病典型皮疹存在，故不首先考虑。②重症肺炎 患儿体温持续不退，胸片提示肺部炎性改变以及出现呼吸困难，肝脏进行性增大，有精神神志改变等均支持诊断，结合患者情况，肺部改变可作为全身病毒感染的一部分。③败血症、中毒性脑病 患儿持续高热，在疾病发展过程中出现精神神志改变，肝脏进行性增大，C反应蛋白进行性增高，肺部影像学改变，不能排除在病毒感染的基础上并发细菌感染导致的多脏器损害，但目前胸片特征不支持败血症性肺炎，可再次予以胸片检查，以便鉴别。④ 化脓性脑膜脑炎 患儿有持续高热及神经系统的症状和体征，结合患儿年龄，需进行鉴别，但目前患儿病程已三天，脑脊液改变不支持其诊断。
       （二）诊断和治疗体会
       1. 当肠道病毒感染患儿体温持续不退、同时伴有精神改变、神经系统症状时需密切观察，尤其是对一些皮疹不明显或皮不典型的患儿需留院观察。
       2. 对手足口病患儿出现神经系统症状（尤其是有脑干累及的迹象时）应尽早使用糖皮质激素和静脉丙球，降低颅内压措施应加强。
       3.在病程中当有不能解释的心率增快、肝脏进行性增大，应考虑有心脏功能受损的存在，应适时给予正性肌力药物辅助治疗。

典型病例三
      一、一般情况和流行病学资料
      患儿，男，15月，发育正常，营养中等。发病前所在社区有手足口病发病患儿。
       二、 病后就诊情况
       发热伴手、足、口皮疹3天就诊。
       三、临床症状和体征
       发病3天来患儿体温波动于38-38.5℃，轻微流白涕，无明显畏寒、寒战，无胸闷、气急，无恶心、呕吐，无腹痛、腹泻，伴口腔粘膜有多个疱疹，患儿拒食明显，双手和脚掌部位多发红色斑丘疹，不痛、不痒，病后无其他明显不适。入院查体：神志清，精神稍软，营养良好，口腔粘膜有多个疱疹，双手和脚掌可见红色斑丘疹，不痛，不痒，颈软，无颈抵抗，心肺听诊无明显异常，腹软，肝脾肋下未及，四肢肌力正常，病理征未引出。
       四、实验室检查
       5月10日血常规：WBC12.0*10^9/L，NE59.1%,L35.0%,HGB116g/L，PLT350*10^9/L。（2008.05.11 义乌市中心医院）血常规：WBC11.9*10^9/L，NE58.9%,L35.4%,HGB115g/L，PLT361*10^9/L,CRP1mg/L。脑脊液常规提示：无色，清，WBC：33 /uL，N58%，L42%，TP440mg/L。大小便常规、电解质、血糖正常，肝肾功能、心肌酶谱基本正常。
       五、病原学检查
        粪EV71阳性。
       六、影像学和心电图等其他检查
       脑脑电图示：轻-中度异常。心电图基本正常。
       七、住院经过和病程转归
       入院后初步诊断：发热、皮疹待查：水痘？手足口病？鉴于患者发热伴有血象白细胞升高，中性粒细胞比例正常，暂给予头孢三嗪1.0g,qd抗感染。
       2008.05.11上午患儿体温仍38℃，鼻流涕较前略有好转，查体：神志尚清，精神较入院更软，口腔和双手、脚掌多发疱疹基本同前，颈无抵抗，心肺检查无明显阳性发现，腹软，肝脾肋下未及，四肢肌力正常，病理征未引出。2008.05.11下午13时许患儿精神明显变差，呈昏睡状态，对外界刺激几乎无反应，无惊厥、抽搐，无恶心、呕吐，无大小便失禁或潴留。急查脑脊液、血常规、大小便常规、肝肾功能、电解质、血糖、脑电图、心肌酶谱等，结果见上述，经义乌市中心医院专家会诊：⑴、患儿，15月，既往一般情况可，追问病史发病前所在社区有类似疾病患儿。⑵、以“发热伴手、足、口皮疹3天”入院。⑶、查体：口腔粘膜有多个疱疹，患儿拒食明显，双手和脚掌部位多发红色斑丘疹，不痛、不痒。⑷、入院后所有检查结果发现血常规白细胞总数略有升高，脑脊液常规提示：无色，清，WBC：33 /uL，N58%，L42%，TP440mg/L。脑电图提示轻-中度异常。其他检查无明显阳性发现。所以结合现有资料，首先考虑诊断手足口病。由于患儿入院后精神一直较软，并逐渐出现昏睡表现，但颈抵抗和病理反射多次检查均未引出，所以考虑手足口病重症，并发脑炎，建议行手足口病病原学检查，必要时考虑核磁共振检查排除其他颅脑器质性疾病。遂给予病危通知、心电监护、鼻导管吸氧，药物治疗给予头孢三嗪1.0g,qd抗感染，更昔洛韦10mg/kg,q8h抗病毒，20%甘露醇50ml、q6h脱水，人丙种免疫球蛋白10g，q12h，静滴，甲强龙20mg静注及其他维持水、电解质、酸碱平衡等措施，经10余个小时的积极抢救治疗，2008.05.12晨7时半患儿一般情况好转，生命体征逐渐平稳，查体：T37℃，P130次/分，R30次/分，SPO2 99%，神志转清，精神状况及对外界刺激的反应能力明显好转，颈软，无抵抗，病理反射阴性，四肢肌力正常，病情好转。2008.05.13患儿体温基本恢复正常，鼻流清涕逐渐减少，神志清，精神好转，拒食较前好转，颈软，无抵抗，病理反射阴性，四肢肌力正常，给予停心电监护，改病重通知。2008.05.14患儿体温恢复正常，鼻流清涕基本消失，精神状态明显好转，无其他明显不适，查体无明显阳性发现，给予停病重通知，并改20%甘露醇50ml，bid，甲强龙10mg，其他治疗无明显改变。之后3天患儿情况进一步好转，体温持续正常，精神状态及对外界反应能力均与入院前无明显差别，逐渐停用或减少甘露醇、抗生素、丙种球蛋白、激素等，患儿住院治疗7天，痊愈出院。 
      八、经验总结
       （一）鉴别诊断
       重症手足口病患者并发脑炎时，需注意和以下疾病相鉴别：
       1、中毒型菌痢 2～7岁儿童多发，夏秋季发病为主；一些患者在消化系统症状出现前，即可有高热、神经系统症状（惊厥、昏迷）和（或）休克表现，可迅速发生中枢性呼吸衰竭；一般无脑膜刺激征，脑脊液改变不明显；大便或灌肠液可查见大量脓细胞及吞噬细胞或红细胞，培养有痢疾杆菌生长。
       2、乙型脑炎 儿童及青少年多发，多在7～9月发病；起病前1～3周内，在流行地区有蚊虫叮咬史，大多近期内无乙脑疫苗接种史；临床可表现为突起发热、头痛、恶心、呕吐、意识障碍，且在2～3天内多进行性加重。小儿常见凝视与惊厥；重症病人可迅速出现昏迷、抽搐、吞咽困难及呼吸衰竭等表现；血常规：白细胞计数一般在10～30×109/L，中粒细胞增至80%以上，核左移，嗜酸粒细胞可减少；脑脊液检查与本病相似；病毒分离及抗体有助确诊。　
       3、化脓性脑膜炎 5岁以下儿童多发，多在春季发病；部分病例起病前有上呼吸道和消化道感染病史；临床表现为发热、意识障碍、头痛、呕吐、脑膜刺激征阳性，部分患者还可有颅内压升高的其他表现；重者甚至可发生脑疝、呼吸衰竭；血常规：白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高；脑脊液检查：压力增高明显，脑脊液外观混浊或为脓样，细胞数明显增多，中性粒细胞占绝大多数，糖定量明显降低或消失，蛋白显著增加，氯化物减少，脑脊液涂片、培养可找到致病菌；
       4、结核性脑膜炎 多见于3岁以下儿童；起病慢，有结核病灶或结核病接触史，发热、消瘦、性情改变，头痛、呕吐； 意识障碍进行性加重，抽搐，脑膜刺激征阳性，病理反射阳性；结核菌素试验大多阳性；脑脊液检查：压力增高，外观无色透明或呈毛玻璃样，静置12～24小时后有薄膜形成，涂片检查结核菌检出率较高，白细胞50～500×106/L，分类以淋巴细胞为主，氯化物明显降低，糖减少，蛋白量增多，一般多在1.0～3.0g/L；胸部Ｘ线检查：可有结核病源，眼底镜检查发现脉络膜有结核结节可助诊断。
       5、隐球菌脑膜炎 多有长期应用广谱抗生素或免疫抑制剂史；起病慢，病程长，早期可有不规则低热或间歇性头痛，后来变为持续性并进行性加重；头痛剧烈，视力障碍等，颅内压增高症状比较明显；脑脊液呈蛋白细胞分离，糖量显著降低，及脑脊液涂片墨汁染色可找到厚荚膜圆形发亮的菌体，抗结核治疗无效。　
       6、Reye综合症 多见于4～12岁儿童，6岁高峰；在病前2周内常有上呼吸道和消化道病毒感染的前驱症状；脑部损害，为本病最为突出的表现。起病急，常反复惊厥、昏迷，严重者出现去大脑强直状态，可因脑疝、呼吸衰竭而死亡；肝脏损害，表现肝脏肿大，伴有肝功能异常，多无黄疸；多数伴有低血糖，高氨血症，脑脊液检查压力升高，但细胞数和蛋白多在正常范围之内；确诊依赖于肝脏的活体组织检查。
       7、脑出血 在儿童常有脑血管畸形病史；临床可突然出现头痛、恶心、呕吐，同时可有偏瘫、抽搐、意识障碍；脑干出血可导致呼吸、心跳骤停死亡；脑脊液压力增高，可为血性； 脑CT检查有助于诊断。
       （二）手足口病脑炎的处理原则：
       1、控制颅内高压：限制入量，给予甘露醇0.5～1.0g/Kg/次，每4～8小时一次，20～30min静脉注射，根据病情调整给药间隔时间及剂量。必要时加用速尿；
       2、静脉注射丙种免疫球蛋白，总量2g/Kg，分2～5次给予；
       3、酌情应用糖皮质激素治疗，参考剂量：甲基强的松龙1～2mg/（Kg•d）；氢化可的松3～5mg（Kg•d）；地塞米松0.2～0.5mg/（Kg•d），分1～2次。重症病例可给予短期大剂量冲击疗法；
       4、其他对症治疗：如降温、镇静、止惊（安定、鲁米那、水合氯醛等）；
       5、严密观察病情变化，密切监护，注意严重并发症。

典型病例四
       一、一般情况和流行病学资料
       患儿，男，4岁，发育正常，营养良好。发病前所在幼儿园有类似疾病史。
       二、发病后就诊
       发现手足口肛周皮疹2天就诊。
       三、临床症状和体征
       2天前家属发现患儿口腔内可见数个溃疡，手、脚掌和肛周伴有些许红色斑丘疹，初未在意，未给予诊治。2天来患儿皮疹无明显消退，同时皮疹逐渐增多，伴有患儿进食较前有所减少，手试发现患儿有发热，其他一般情况尚可，遂送至义乌市中心医院就诊。入院查体：T37.9℃，P88次/分，R18次/分，神志清，精神稍软，营养好，手心、足底、肛周可见红色斑丘疹，疱疹周围有炎性红晕，口腔下唇粘膜上可见多个溃疡，颈软，无抵抗，心肺听诊未见明显异常，腹软，肝脾肋下未及，四肢肌力正常，病理征阴性。
       四、实验室检查
       入院时血常规：WBC12.9*10^9/L,N70.7%,L21.1%,HGB124g/L,PLT294*10^9/L（入院时）。（入院第二天）血常规：WBC12.5×10^9/l,N72.1%,L20.8%,HGB123g/l,PLT304*10^9/l;肝肾功能及心肌酶谱基本正常。 
       五、病原学检查
       病毒检测结果：EV71阳性。
       六、影像学和心电图等其他检查
      入院第二天：胸片示两肺纹理增多增粗。心电图示窦性心动过速（哭吵）。
        七、住院经过和病程转归
        入院后结合患者血常规提示白细胞总数升高，伴有入院时体温37.9度，给予头孢三嗪1.0g,qd预防感染、更昔洛韦 10mg/kg,bid及补液等对症支持治疗。但第二天，患儿体温逐渐上升，体温最高达40.2℃，呈稽留热型，查体：患儿神志清，精神软，口腔、手、脚掌和肛周皮疹较前变化不大，颈软，心肺检查无明显阳性发现，腹软，肝脾肋下未及，四肢肌力正常，病理征阴性。给予物理降温和小剂量激素，其他药物治疗同前，并再次复查血常规、肝肾功能和心肌酶谱、胸片、心电图等检查，血常规仍提示白细胞增多，其他无明显阳性发现。第三天患者体温仍未降至正常，波动于39.5～40℃，查体：患儿神志清，精神较软，其他查体无明显阳性发现，继续给予同上降温治疗。第四日体温逐渐下降，神志清，精神明显好转，停用退热药物。住院治疗5天后，体温降至正常，患儿无明显不适主诉，痊愈出院。
       八、经验总结
      虽然手足口病病情变化因人而异，但是绝多数病人病程自限，经过积极对症治疗后多预后良好。手足口病的疱疹，需和以下疾病鉴别：
       1、口蹄疫： 由口蹄疫病毒引起，属于人畜共患病原体；一般发生于畜牧区，成人牧民多见，四季均有；主要侵犯猪、牛、马等家畜，对人虽然可致病,但不敏感；先出现兽疫，后可能使人患病。临床表现为全身中毒症状和局部疱疹损害两大特征，虽患病部位在口腔 手指间、足趾端有相似之处，但口蹄疫的疱疹易破溃，容易继发感染成脓疱，随后结痂、脱落。而手足口病的传染源是患者和肠道携带病毒的人，属于人类疾病；手足口病的手足疱疹不易破溃。
       2、水痘： 由带状疱疹病毒感染引起，多发于5～9岁儿童；冬春季发病为主；皮疹呈向心性分布，多见于躯干和头部，而四肢较少；同时可见斑疹、丘疹、疱疹及痂疹等多形性皮疹；皮疹新老并存；皮疹痒，皮薄易破。
       3、疱疹性口炎： 由单纯疱疹病毒感染引起；多发于3岁以下，四季均可发病，以散发病例为主；病损常累及齿龈；皮疹较少见；多同时伴有颏下或颌下淋巴结肿痛。
       4、丘疹性荨麻疹： 多发于3岁以下儿童；夏秋季发病为主；皮疹呈梭形，大小似花生米，较硬，壁厚而不易破，皮疹四周往往出现红斑，顶端中央常有透明的水疱，剧痒，夜间甚；常见于四肢伸面，尤以下肢为多，左右不一定对称，但一般不累及头皮及黏膜；病程短，一般无淋巴结肿大。若因搔破而继发感染，则可形成局部化脓，附近淋巴结也可显著肿大。
       5、疱疹样皮炎： 多见于成人，但也有发生于5岁以上的小儿；皮疹为多形性，可有红斑、丘疹、风团、丘疱疹、水疱、血疱、脓疱等，其中以红斑、丘疹、丘疱疹和水疱较常见，皮疹常排列成环状或不规则状，并以成群分布的水疱为主；水疱大小不等，最大直径可达l～2厘米，水疱紧张饱满，疱壁厚，不易破裂，周围常伴有红晕；皮疹常对称分布，好发于四肢伸侧、腋下、肩胛部、臀部等易受摩擦的部位，也可发于面部、躯干、头皮等部位，罕有口腔粘膜损害；皮疹瘙痒剧烈；皮疹消退后常有色素沉着。病情反复发作、病程呈慢性经过，但一般预后良好。
       6、脓疱疮：儿童多见，多发生于夏秋季节；传染性强，常在托儿所、幼儿园中引起流行；皮疹形态：初起时为红斑、丘疹或水疱，迅速变成脓疱，疱壁薄易破，瘙痒；好发于颜面部、颈、四肢等暴露部位；重症患者可伴有高热、淋巴结肿大或引起败血症；实验室检查：白细胞总数及中性粒细胞增高，脓液细菌培养为金黄色葡萄球菌或溶血性链球菌。