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生物芯片及其应用

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  生物芯片技术起源于核酸分子杂交。所谓生物芯片指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子(如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白质)的微阵列,阵列中每个分子的序列及位置都是已知的,并且是预先设定好的序列点阵。 
  简单地说,生物芯片就是在一块指甲大小的玻片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品,然后由一种仪器收集信号,用计算机分析数据结果。

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生物芯片的分类编辑本段回目录

  生物芯片虽然只有10多年的历史,但包含的种类较多,分类方式和种类也没有完全的统一。
  
根据用途分类

  (1)生物电子芯片:用于生物计算机等生物电子产品的制造。
  (2)生物分析芯片:用于各种生物大分子、细胞、组织的操作以及生物化学反应的检测。
  前一类目前在技术和应用上很不成熟,一般情况下所指的生物芯片主要为生物分析芯片。
  
根据作用方式分类

  (1)主动式芯片:是指把生物实验中的样本处理纯化、反应标记及检测等多个实验步骤集成,通过一步反应就可主动完成。其特点是快速、操作简单,因此有人又将它称为功能生物芯片。主要包括微流体芯片(microftuidic chip)和缩微芯片实验室(lab on chip)。
  (2)被动式芯片:即各种微阵列芯片,是指把生物实验中的多个实验集成,但操作步骤不变。其特点是高度的并行性,目前的大部分芯片属于此类。由于这类芯片主要是获得大量的生物大分子信息,最终通过生物信息学进行数据挖掘分析,因此这类芯片又称为信息生物芯片。
  
根据固定在载体上的物质成分分类  
  (1)基因芯片(gene chip):又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。
  (2)蛋白质芯片(protein chip或protein microarray):是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。
  (3)细胞芯片(cell chip):是将细胞按照特定的方式固定在载体上,用来检测细胞间相互影响或相互作用。
  (4)组织芯片(tissue chip):是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上,用来进行免疫组织化学等组织内成分差异研究。
  (5)其他:如芯片实验室(Lab on chip),用于生命物质的分离、检测的微型化芯片。现在,已经有不少的研究人员试图将整个生化检测分析过程缩微到芯片上,形成所谓的“芯片实验室”(Lab on chip)。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室已经问世,并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片。例如可以将样品的制备和PCR扩增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如Gene Logic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA,并对其进行荧光标记,然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积,所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时,由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用,所以可以加速杂交反应,缩短测试时间,从而降低了测试成本。

生物芯片的制备编辑本段回目录

  ●载体材料及要求:作为载体必须是固体片状或者膜、表面带有活性基因,以便于连接并有效固定各种生物分子。目前制备芯片的固相材料有玻片、硅片、金属片、尼龙膜等。目前较为常用的支持材料是玻片,因为玻片适合多种合成方法,而且在制备芯片前对玻片的预处理也相对简单易行。
  ● 载体种类:玻璃片、PVDF膜、聚丙烯酰氨凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠。
  点样机● 生物样品的制备:分离纯化、圹增、获取其中的蛋白质或DNA、RNA并用荧光标记, 才能与芯片进行反应。 用DNA芯片做表达谱研究时,通常是将样品先抽提mRNA,然后反转录成cDNA。同时掺入带荧光标记的dCTP或dUTP。
  ● 芯片制备方法:包括原位合成和预合成后点样。
  原位合成:适用于寡核苷酸,通过光引导蚀刻技术。已有P53、P450,BRCAI/BRCA2 等基因突变的基因芯片。
  预合成后点样:是将提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因组DAN等通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。该技术优点在于相对简易低廉,被国内外广泛使用。
  接触式点样:是指打印针从多孔板取出样品后直接打印在芯片上。打印时针头与芯片接触。优点是探针密度高,通常一平方厘米可打印2500个探针。 缺点是定量准确性及重现性不太好。
  非接触式点样:针头与芯片保持一定距离。优点是定量准确重现性好,缺点是喷印的斑点大,密度低。通常一平方厘米只有400点。但是日本佳能公司 能把喷印点直径大小由150-100μm降到30-25μm。可将哺乳动物整个基因组DNA点阵于一张芯片上成为可能。

常见的生物芯片编辑本段回目录

样品制备芯片

   生物样品往往是复杂的混合物,在大多数情况下需要先对生物样品进行预处理,即样品制备。以核酸样品制备为例,它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取DNA等多步工作。这些工作可以在样品制备芯片上完成。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离和介电电泳分离等;芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、高压脉冲破胞以及化学破胞等。
过滤分离芯片

   过滤分离即根据生物颗粒的尺寸差异进行分离。针对人白细胞的分离,1998年美国宾夕法尼亚大学的研究小组研究出了一种芯片微过滤法。芯片微过滤器的工作原理是根据人白细胞的尺寸比红细胞大的特点,使人外周血流过微过滤器时只让血浆和尺寸较小的红血细胞及血小板通过,而截住尺寸较大的白细胞。加工微过滤用芯片是通过在硅片上刻出各种形状的过滤通道,通道直径为几个微米,然后再在硅芯片上键合上一块玻璃盖片而完成。通过反复试验和设计,微芯片过滤器已从最初的竖式Z形结构,通过竖式条状梳式结构过渡最后定型为横坝式结构。采用横坝式结构的优点是人白细胞的回收率高,过滤器不易被堵塞。微芯片过滤器的另一应用是它可将孕妇外周血中极少量的胎儿细胞过滤出来,供下一步作产前诊断之用。
介电电泳分离芯片

   介电电泳分离的原理是细胞在高频不均匀电场作用下产生极化,不同的细胞由于介电特性、电导率、形状不同而感应出不同的偶电极,因此受到不同介电力的作用。利用介电电泳方法制备样品的优点是:通过测量细胞的运动速度,可以得到细胞的介电特性;可以对细胞进行无物理接触的选择性操纵、定位、分离。
生化反应芯片

   生化反应芯片的目的是把在实验室试管中进行的生化实验缩微到一块小小的芯片上。目前较典型的生化反应芯片包括聚合酶链反应(polymerize chain reac-tion,PCR)芯片、药物合成芯片等,其中PCR扩增芯片是生化反应芯片的典型代表。
   在芯片上进行PCR扩增反应的背景是,目前在生物芯片领域中所用的检测仪器灵敏度还不够高,所以从血液或活体组织中提取的DNA在标记或应用前都需要扩增复制。例如,在对一个肿瘤的活体解剖样品进行检测时,需要在几千个正常基因中找到一个异常的癌基因,显然这需要对样品DNA进行必要的扩增复制才易于检测。PCR作为生物学中最常用的DNA扩增手段,由变性、延伸、退火三个步骤所构成,其每个步骤的工作温度大约分别为95℃、72℃、60℃。通过该反应可将极微量的DNA成千上万倍地扩增,以满足实验需要。
   除了上述方法外,另一个更简易的方法是将帕尔帖器件(一种可通过改变器件两端电压的极性而产生加热或致冷效果的半导体器件),直接贴在PCR扩增芯片的背面,人们只需控制帕尔帖器件的温度在三个恒温区之间变化,就能在芯片上实现PCR扩增。

检测芯片编辑本段回目录

   检测芯片主要包括毛细管电泳芯片和微阵列芯片两类。

毛细管电泳芯片

   毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)对于DNA测序、司法鉴定、PCR产物分析来说是一个强有力的手段。与平板凝胶电泳相比,毛细管电泳能更快速、更准确地分离DNA片段,这是因为可以在毛细管两端加上更高的电压。毛细管电泳的缺点是一次只能分析一个样品,毛细管微阵列电泳将平板凝胶电泳和毛细管电泳两种方法的优点结合起来,在毛细管微阵列上并行地进行电泳,它能增大电泳泳道数目、提高电泳速度,是一种有着巨大应用前景的方法。
   在毛细管电泳的基础上,近几年发展出集成度更高的集成毛细管电泳技术。集成毛细管电泳技术是在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀出毛细管槽,用盖板封闭好后,在毛细管中填入媒体,使电泳分离的整个过程集成到一块几平方厘米的基片上。集成毛细管电泳芯片具有高效、快速、试样用量少等优点,并已经在免疫测定、DNA分析和测序、氨基酸和蛋白质分析、生物细胞研究方面得到应用。
   伍利(A. T. Woolley)等人报道的方法,利用光刻掩膜和化学刻蚀技术在玻璃基底上光刻出微通道阵列,然后使基底与另一块玻璃片键合构成毛细管阵列,其中上层玻璃片上钻有小孔作为样品输入孔。DNA片段在缓冲液中被荧光标记,最后利用激光共焦荧光探测系统检测毛细管电泳的结果。
   拉加利(E. T. Lagally)等人构建了一种将PCR反应和毛细管电泳集成在一起的PCR-CE器件。他们将热循环所需的加热元件直接微加工在器件上,升温/降温的速度为每秒10℃,每一次PCR热循环的时间为30秒,利用50纳升容量的微阀和疏水性出口将样品输运到200纳升容量的PCR反应腔中。基于该集成化PCR-CE器件,能够实现对单个DNA分子的扩增和检测。
   此外刘英杰等人还构建了一种基于聚碳酸酯材料的集成毛细管器件来分析DNA样品。他们利用压模方法加工出毛细管微通道,聚碳酸酯材料在键合前接受了紫外线辐射以增强亲水性。实验表明该器件能显著区分长度为100个碱基对、200个碱基对……1500个碱基对等的DNA片断。 
微阵列芯片

   DNA微阵列芯片基于DNA杂交反应的原理,先将许多DNA片段末端固定在芯片上,然后让荧光标记的样品核酸通过流路或加样至芯片上,杂交反应结束后清洗芯片,留在芯片上的样品核酸即可用荧光检测的方法来检测。由于DNA微阵列芯片不要求先对基底做微细加工,因此可利用自动化或化学合成方法在基底上直接施加或合成生化物质。目前有4种典型的DNA微阵列芯片制备方法:光引导原位合成法、接触式点涂法、化学喷射法、压电喷射原位合成法。
   光引导原位合成法是将微电子工业中的光刻技术与DNA的光化学合成方法相结合。首先把用光敏保护基团保护的4种核苷酸固定在玻片上,然后根据设计要求用不同的掩模板对玻片进行掩蔽,光照处的光敏保护基团分解,暴露的地方即可加上新的被保护的核苷酸,如此循环下去就能以很高的密度和精度来制备DNA微阵列芯片。现在人们已经能在1.6厘米2的玻片上合成40万组寡核苷酸。这种方法的缺点是需要花费大量的时间和成本来制备掩模板,因为寡核苷酸的每个碱基位需要4块掩模板,合成一个25个碱基对的微阵列芯片就需要100块掩模板。
   接触式点涂法先将DNA探针合成好,然后通过一个点接触装置自动地将探针点到玻片上的指定地点。点接触法的优点是快速、经济、多功能,缺点是每种样品都必须是合成好、经过纯化并事先保存的。
   化学喷射法是以定滴供给的方式,通过压电晶体或其他推进形式从喷嘴内将生物样品喷射到玻璃基片上。喷射法所需的样品是已经合成好的DNA,它与点接触法的区别是喷嘴不与玻片接触。
   压电喷射原位合成法主要包括两个步骤:先在直径为75毫米的二氧化硅基底上制备高密度的小坑,每个小坑的直径为100微米,间距30微米,共约10万个小坑,小坑内作羟基化亲水处理,小坑间作氟化疏水处理,这样得到的小坑即可作为DNA合成的微型反应池;然后根据实际要求,在4个压电喷头中分别装入A、T、G、C核苷酸,由计算机控制微阵列DNA芯片x-y方向的运动,将4种核苷酸喷射到适当的小坑中,由此在预制的基底上并行合成出微阵列DNA芯片。

生物芯片的光学检测和数据处理编辑本段回目录

   对DNA芯片上所包含的信息进行准确检测是一项至关重要的工作。早期的方法是同位素标记法,应用时需经过曝光、显影,然后用具有寻址功能的扫描仪扫读。目前在生物芯片信息采集中使用最多最成功的是荧光标记法,这种方法不受同位素的使用限制,用激光作为激发光源的共焦扫描装置具有极高的灵敏度、分辨能力和定位功能,并能定量地输出结果。
   近年来,纳马西瓦亚姆(V. Namasivayam)等人构建了一种将荧光检测装置直接集成在生物芯片上的方法,这更加提高了生物芯片的集成度。他们在硅上加工出光电二极管,并与芯片上的微流体系统相结合,可以实现0.9纳克/微升的DNA检测精度,信噪比为100∶1。
   由于利用生物芯片可以一次性地得到大量实验数据,因此需要一个专用的软件系统来处理数据。完整的生物芯片数据处理系统,应该包括芯片图像分析和数据提取,芯片数据的统计学分析和生物学分析,芯片的数据库积累和管理,芯片表达基因的国际互联网检索,表达基因数据库分析和积累等功能。

生物芯片中的微流体技术编辑本段回目录

   在生物、化学、材料等科学实验中,经常需要对流体进行操作,如样品DNA的制备、PCR反应、电泳检测等操作都是在液相环境中进行。如果要将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上,则实验所用流体的量就从毫升、微升级降至纳升或皮升级,这时功能强大的微流体装置就显得必不可少了。因此随着生物芯片技术的发展,微流体技术作为生物芯片的一项关键支撑技术也得到了人们越来越多的关注。
   与微电子技术不同,微流体技术不强调减小器件的尺寸,它着重于构建微流体通道系统来实现各种复杂的微流体操纵功能。与宏观流体系统类似,微流体系统所需的器件也包括泵、阀、混合器、过滤器、分离器等。尽管与微电子器件相比,微通道的尺寸显得相当大,但实际上这个尺寸对于流体而言已经是非常小。微通道中的流体流动行为与人们在日常生活中所见的宏观流体流动行为有着本质的差别,因此微泵、微阀、微混合器、微过滤器、微分离器等微型器件往往都与相应的宏观器件差别甚大。
   为了精确设计微流体系统中所需的器件,首先要确定微通道中流体的流动性质。现在人们利用共焦显微镜成像技术可以方便地对微通道中的流动过程进行量化,达到了以往无法实现的高分辨率。世界上第一个微流体器件由英国帝国理工大学(Imperial College)的曼齐(A. Manz)、美国橡树岭国家实验室的拉姆齐(M. Ramsey)等科学家在1990年代初研制成功。该器件是利用常规的平面加工工艺(光刻、腐蚀等)在硅、玻璃上制作的。尽管这种制作方法非常精密,但成本高,且不灵活,无法适应研发需求。最近怀特赛兹(G. M. Whitesides)等人提出一种“软光刻”微加工方法,即在有机材料上印制、成型出微结构,从而能方便地加工原型器件和专用器件。另外这个方法还能构建出三维微通道结构,并能在更高层次上控制微流体通道表面的分子结构。
   喷射技术是最成熟的微流体技术,它使用直径小于100微米的孔来产生微滴。这项技术可用于输运微反应中的微量试剂,以及将微量DNA样品分发到载体表面形成微阵列(参见DNA芯片制作中的化学喷射法、压电喷射原位合成法)。前面提到的集成毛细管电泳技术也是近几年出现的另一项微流体技术。

表达谱基因芯片编辑本段回目录

检测原理
用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针,将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤,用特有的荧光波长扫描芯片,得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片,再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。是基因功能研究的一种重要手段。

应用意义
对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以,无论何种研究领域,利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因,使研究更具目的性和系统性,同时也拓宽研究领域。
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点:
1. 检测系统的微型化,对样品等需要量非常小
2. 同时研究上万个基因的表达变化,研究效率明显提高
3. 能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系,从而研究基因与基因之间内在的作用关系
4. 检测基因表达变化的灵敏度高,可检测丰度相差几个数量级的表达情况
5. 节约费用和时间

制作技术
光引导原位合成

原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片,具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物,可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基,通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前,预先将玻片氨基化,并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板使需要聚合的部位透光,不需要发生聚合的位点蔽光。这样,光通过挡光板照射到支持物上,受光部分的氨基解保护,从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护,所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类,就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于照相平板印刷技术每步的合成效率较低(95%),合成30nt的终产率仅为20%,所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸。在此基础上,有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合,以酸作为去保护剂,将每步合成产率提高到99%,但制造工艺复杂程度增加了许多。所以如何简便地提高合成产率是光引导原位合成技 术有待解决的问题。 

打印原位合成
压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机,合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为:合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理,使其带有反应活性基团,例如伯氨基。同时,将合成用前体分子(DNA合成碱基、cDNA和其它分子)放入打印墨盒内,由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动,并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂(不足纳升)喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护,所以每步延伸的合成产率可以高达99%,合成的探针长度可以达到40~50nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。

点样法
点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上,并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理,例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成型的点样装置出售,例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以,“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列(例如2500点/cm2),“喷印”法由于“喷印”的斑点较大,所以只能形成较低密度的探针阵列,通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取,适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵,用于科研和实践工作。 
目前,除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外,大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。

检测和分析
检测的原理
   荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中,多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析,多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性,排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能,包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积(5-200ul)比传统的分析要小的多(5-50ml),小反应体积降低了试剂的消耗,增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度(0.1-1um),相对于传统分析(0.1-4pm)增加100000倍之多,浓度的增加又能加速杂交的速度,从而减少获得强荧光信号的时间,并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。 对于以核酸杂交为原理的检测技术,主要过程为:首先用生物素标记经扩增(也可使用其它放大技术)的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素(常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin)作为显色物质,图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描,由计算机收集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性,所以,前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说,该检测方法是具有一定特异性的,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。

荧光探针
目前用荧光探针作为检测信号的仪器,主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率,以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。
(一)PCR过程中的DNA标记
  1.末端标记:在引物上标记有荧光探针,在DNA扩增过程时,使新形成的DNA链末端带有荧光探针。
  2 .随机插入:选择四种缄机基,使其中一种或几种挂有荧光探针,在PCR过程中,带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基,同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基,可能影响PCR的产物,因此,需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率,以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平,使杂交信号最强。
(二)RNA转录过程的荧光探针标记
  某一种碱基标记有荧光,但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合,以达到最佳转录效果。
(三)荧光探针的选择  
  主要考虑以下几个因素:  
   荧光探针的激发和发射频谱;
   荧光探针的发光效率;  
   荧光探针对PCR或逆转录效率的影响;
   不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。
  常用的荧光探针:FITC,CY-3,ALEAX488,CY-5,ALEAX564

聚焦扫描和CCD扫描仪
一旦荧光标记样品和微阵列反应后,未结合的成分就可洗去,结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域(约100um2)的激光发晒透镜(或两者)使整个影像聚集,每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜,光片和晶体后与不要的光分开,然后被光电倍增管(或一种类似的装置)转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度(1-5min)要比传统实验中的放射自显影快的多(1-10天),快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。

生化反应
杂交反应概述
该过程指将从生物样品分离到的蛋白、DNA或RNA样品与生物芯片进行反应,从固定于芯片的探针阵列得到样品的序列信息。由于玻片本身的荧光本底很低,所以可用荧光标记的方法来对生物芯片实施检测和分析,同时具有快速、精确和安全等优点。而且,还可用多个荧光素进行标记以实现一次性分析多个生物样品。玻片作为支持物还可使反应体积缩小到5-200μl,而通常的杂交反应体积为5-50ml。这样一方面节约了试剂,同时还可以提高反应试剂的有效浓度(0.1-1μM),是常规检测(0.4-4pM)的一万倍。因此促进了杂交速度减少了杂交时间,并可取得较强的荧光信号。
 
核酸样品
   RNA样品通常需要首先逆转录成cDNA并进行标记后才可进行检测。目前,由于检测灵敏度所限,尚难以普通探针对极少量的核酸分子进行杂交和检测,所以需要对样品或后续测试信号进行适当的放大。多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增,例如通过PCR方法,以使样品核酸的拷贝数有所提高达到检测的灵敏度。但用DNA芯片进行检测分析时需要对样品大量的DNA片段进行扩增和标记,所以需要同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增,这是一项工作量非常巨大的工作。顺应这一要求出现了许多解决办法,并在不同程度上减轻了工作量。例如,Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法,将多对引物固定于支持物上(其位置和序列信息预定),以类似于原位PCR的方式一次性对样品多个片段进行扩增和放大,而且不会由于引物种类过多而出现相互间的竞争和抑制(这种情况曾出现于多重PCR中)。引物具有较强的特异性,扩增反应也不存在交叉污染,因而省略了处理常规多重和多个PCR反应的繁琐工作。再如,Lynx Therapeutics公司引入的大规模并行克隆(massively parallel solid-phase cloning),可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆,且无需单独处理和分离每个克隆。
   除了检测前对样品分子的放大外,通常仍需要有高灵敏度的检测设备来采集、处理和解析生物信息。但,亦有不经过对样品的扩增和放大而直接应用特殊处理的探针,例如分支探针技术,而达到较高的检测灵敏度水平。这种方法的原理是,设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针,分支末端以酶标记。这样,经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。该技术比较成功的例子就是HCV与HBV的检测。它的最大优点在于其操作简便,具有较高的灵敏度,同时也可以保证检测结果的特异性[2]。当然,由于不同检测方式的灵敏度不同对于样品的处理和扩增情况的要求亦有所不同,具体的处理和放大方法仍需根据实际情况进行选择。
 
蛋白及其它生物样品
同样,基于生物大分子相互作用原理的生物芯片在检测时生物样品的处理遵循相似的方式,即信号的放大和样品的标记。例如,蛋白芯片在进行检测和分析时,可以将待分析的蛋白样品用荧光素或其它物质进行标记,然后与生物芯片上的生物大分子进行相互作用,最后依据标记物质的不同采取相应的检测方式采集和分析样品和芯片上生物大分子相互作用的结果。对与非核酸类的生物大分子,存在的问题是有时不便于对其进行扩增和放大,因为其它生物大分子的结构相对比较复杂不能进行简便的克隆或扩增。所以,这就向检测的灵敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的检测和分析类似与蛋白分子。例如核酸与蛋白的相互作用,配体间的相互作用,糖与蛋白的相互作用等。

抗体芯片编辑本段回目录

蛋白质是一切生命活动的基础,受基因表达的调控,因而以检测样品中的mRNA为基础的cDNA芯片是当今研究中倍受关注的研究手段。但是,由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等多种调节机制,基因的表达,或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。因此,以微阵列技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白芯片在后基因组时代越来越受重视。抗体芯片(Antibody Microarray,抗体微阵列),是蛋白质芯片的一种,是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度,将极大促进蛋白质组目前的研究状况——因为以现有的技术中对蛋白质进行这种复杂的分析是非常困难的。
Clontech公司第一代的抗体芯片Ab Microarray 380(Cat.No.K1847-1)包含固定在玻璃片基上的378种已知蛋白质的单克隆抗体,可以在一次简单实验中同时检测样品中的378种蛋白质的表达情况,并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。Ab Microarray 380芯片上每个抗体都是并列双点以增加结果的可靠性,抗体针对广泛的胞内蛋白和膜结合蛋白,已知参与信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能,因而可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达模式。尽管抗原来自人,但很多抗体可以识别小鼠或大鼠的样品。详细的资料可以上网查询。
芯片上抗体的选择不但根据其特异性,也根据抗体的结合亲和力,在验证实验中特异性低、交叉反应高、或者信号强度低的抗体都被排除,另外所有抗体都经过检验保证得到的信号与抗原浓度有良好的线性相关,那些没有良好的线性剂量关系的抗体都被排除。因此抗体芯片能够检测到样品中很低的pg/ml浓度的抗原。第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具,可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度;还可以作为DNA芯片的补充,用于研究蛋白和基因表达之间的关系。

操作流程
    抗体芯片并不要求特殊的技能,只要一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括:从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成,你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱(处理体液样品时用)和荧光扫描仪,其他的试剂全部由试剂盒提供。

优化的试剂
    随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液,是专门为抗体芯片而设计的,非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同时能保持蛋白的天然活性(非变性条件),这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性,保证以后的实验结果的真实性,和原始材料的一致性。
内源标准化信噪比(Internally Normalized Ratio)
  根据操作手册进行内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比(INR),内源标准化处理是指对两个样品(A、B)中分别用两种荧光标记分子(Cy3和Cy5)标记,并交叉与芯片杂交(见图,A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交),可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照,也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3,单纯一个实验的结果就会有偏差(Cy5标记的样品信号偏高),用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值,通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值,这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。
     抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因,根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。

蛋白芯片技术编辑本段回目录

    蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片,然后,用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用,经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去,再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术,测定芯片上各点的荧光强度,通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系,由此达到测定各种蛋白质功能的目的。为了实现这个目的,首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上,同时能够维持蛋白质天然构象,也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物活性。另外,由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性,开发和建立具有多样品并行处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯处技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。

蛋白芯片技术的研究现状

    在多年的蛋白芯片技术的研究过程中,研究者为了寻找合适的物质作为蛋白的载体进行了不懈的探索。例如日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂(HTAB)脂质体作为载体,通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体,这种装配体可以在适当的pH条件下,使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面,形成蛋白质的载体。Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体,可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程,使用不同孔数的平板作为载体,建立了约含有6000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统,平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株,可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质,利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物,将蛋白样品置于凝胶上,然后经过电泳分离,使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。最近,哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上,制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白,G按每点为1纳升的点样量点样10799次,另一次用FRB(FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein)点样。为了确保不同分子量 的点样蛋白质都能够被固定在玻片上,他们首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N’-二琥珀酰胺碳酸(N,N,-disuccinimidyl carbonate)激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片,其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。在制备芯片过程中,为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性,他们在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油,以防止因体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将零片浸泡于含有小牛血清蛋白(BSA)的缓冲液中,使芯片表面含有一层小牛血清蛋白,用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基。为了检测芯片的应用,他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBP12(12Kd FK506-binding protein)并作用于蛋白芯片,观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用,其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性,这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析——为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。

蛋白芯片的应用研究

    目前,学者们正在开展有关蛋白芯片技术应用的研究,Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特异抗体抗原成分,他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片,从中找出了4组高度特异性的抗原(蛋白)-抗体复合物,其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明,但是由于表达水平都较低,说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法,可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分,或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用,这将有助于对某些疾病(包括肿瘤)的发病分子机理的研究,以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理,可以将不同的抗体固定于载体上成为抗体蛋白芯片,用于检测不同组织产生的蛋白质。
    Ge在蛋白质的相互作用的研究中,采用了一种通用的蛋白质芯片系统,该系统敏感有效,用途广泛,可定量测定及重复使用,而且操作简易。
Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对没的激酶-作用物系统,即依赖3’,5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂剂激活蛋白(MAP)激酶(ErK2)-E1K1,首先将各系统的作用物按顺序固定于三张BSA-NHS玻片上,分别在有同位素γ-³³P ATP的环境中,与不同蛋白激酶温浴,然后,玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究及代谢机制的分析。
    Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺(即AP1497)等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质,研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片,将BSA分别用没的荧光物质(Alexa488、Cy3,或Cy5)标记,并分与DIC、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探针,用每一种具有不同荧光标记的探针作用地芯片,结果只能有能与小分子对应的受体蛋白被标上荧光。上述结果说明使用的荧光剂之间没有交叉的荧光激发和发光作用,因此,将三种标记探针混合后作用于蛋白芯片,则可使三种不同的受体蛋白同时标记上不同的荧光。研究结果提示蛋白芯片技术对于新药的发掘是十分有用的,因为它对寻找新药作用的靶点非常方便。

主动式生物芯片编辑本段回目录

微流路芯片(microfluidic chip)编辑本段回目录

这是一种通道型的主动式生物芯片,也是目前研究得最多的一类。利用微加工技术和MEMS技术可以在基片上刻蚀出各种微通道或流路以及反应池等,用一定的外力或场驱动样品或反应溶液在其中流动,并制作出微泵、微阀等结构器件以控制液体的流量和方向,将可以实现将生化反应的若干个步骤的集成,从而使生物芯片技术向缩微芯片实验室发展。
但是要将生化分析的全部复杂步骤都集成在一块芯片上并不是一件简单的事。目前问世的都是一些功能较简单或单一的微流路芯片,包括毛细管电泳芯片、PCR反应芯片等。Burns等1998年研制的集成纳升分析芯片融化了多项技术,具有较高智能度和集成度。该装置大小为47mm×5mm×1mm,采用标准光刻蚀和微细加工工艺,在硅基片上构建显微通道及各种复杂装置,在计算机控制下,由芯片外微空气泵驱动栽有反应物、缓冲液及DNA样品的纳升级小液滴——“微射流”在整个芯片上流动。通道中的疏水微区可把小液滴隔开,而埋有聚丙烯基质的区域可进行原位电泳,用裂解液释放细胞中的DNA后,混合物注入反应室,其中的一块玻璃墙靠电荷相互作用,吸附样品中的核酸,经清洗、重溶后流到扩增室,由微加热器提供温度循环进行扩增,然后把DNA转录承RNA并带上荧光标记,送到DNA微阵列进行杂交。
Jacobson等则在进行一种毛细管电层析芯片的研究。他们用光刻蚀技术在玻片上制备5.6μm宽66μm的通道,表面以十八硅烷修饰后做固定相,用电渗流转运流动相。Regnier等用深度活性离子刻蚀法,在石英表面原位刻蚀出单片颗粒状支持结构阵列,以替代常规层析柱中的微粒,移动相通过电渗流在1.5μm宽的通道上转运。

生物电子芯片(bioelectronic chip)编辑本段回目录


由常规分子微阵列构成的芯片,探针与靶分子被动杂交,反应速率受分子扩散限制,故有学者设想构建微电极阵列,利用电场增强杂交。Sosnowski等采用微电子工艺,在热氧化惰性处理的硅片基上构建了25个半径40μm的Pt-Si3N4电极阵列,并在电极上蚀刻出样品池,其上覆盖带有链霉亲和素的琼脂糖凝胶渗透层。在电场作用下,生物素标记的探针被运转到特定的电极上与目的片段杂交,达到了能检测单碱基错配的分辨率。这种杂交不仅反应速度快,通过改变电场强度还可以控制分子结合的强度。
更重要的是,还可在此类芯片上直接制备杂交样品,克服了常规分子微阵列芯片的制样困难。通过在硅片上制作一系列各种排列的金属电极和在这些电极上施加高频电场就可在不同的细胞内感应出偶极,而偶极的出现又反过来使不同的细胞要么承受正介电力,要么承受负介电力,从而能够使他们从各种不同的液体样品中分离出来。1998年,Nanogen公司研制了采用上述介电电泳原理将大肠杆菌从含有人体血细胞的混合物中分离出来的生物电子芯片,同时此芯片在蛋白酶消化作用下完成对细胞的胞解作用。处理后的大肠杆菌中的DNA或RNA经电寻址导向式杂交在另一块芯片上完成杂交分析。
这类芯片发展迅速。1999年,Gilles等在硅片上蚀刻出电子回路和电极构成芯片,经扩增的病人DNA样品在芯片上转运、浓缩并吸附到特定电极上形成阵列,并与荧光标记的探针杂交,快速精确地区分了人甘露糖结合蛋白质基因中复杂的四等位单核苷酸多态性,并把该方法成为电子点杂交。而最近,一种将微电极阵列、微流路和电泳技术结合起来的三维叠层芯片已经在Nanogen公司问世。它与该公司的另一类电寻址探针阵列芯片连接起来,可构成完整的微型实验室分析系统。

电磁式生物芯片编辑本段回目录

这是以清华大学程京教授为首的我国科学家首创的一类主动式生物芯片。它主要是利用外加磁场的作用,通过改变电磁力来改变芯片中DNA或者蛋白质分子的流向和流速,达到分离的目的。此外这种芯片还有效地将电场和磁场的作用结合在一起,通过计算机可控制芯片上任意一点发生的生化反应,具有分析灵敏度高、样品分析时间大为缩短等特点。其中,可单点选通的电磁阵列技术、电旋转检测技术等均为世界首创。

生物芯片的应用编辑本段回目录

基因表达水平的检测

    用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列(其中14个为完全序列,31个为EST),检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平,用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交,经激光共聚焦显微扫描,发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异,而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列,来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异,发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达,11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后,用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。  

基因诊断

   从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱,就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司,把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成P53基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用。又如,Heller等构建了96个基因的cDNA微阵,用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在,肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

药物筛选
   如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍,基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段,它能够大规模地筛选、通用性强,能够从基因水平解释药物的作用机理,即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再c DNA表达文库得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有,利用RNA、单链DNA有很大的柔性,能形成复杂的空间结构,更有利与靶分子相结合,可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上,然后与靶蛋白孵育,形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物,可以筛选特异的药物蛋白或核酸,因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中,Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸,并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物,实验表明,这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选,靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步,美国很多制药公司已开始前期工作,即正在建立表达谱数据库,从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

个体化医疗

    临床上,同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用,而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面,病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸多态性,SNP),导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关,如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用,大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异,这些变异除对药物产生不同反应外,还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断,再开处方,就可对病人实施个体优化治疗。另一方面,在治疗中,很多同种疾病的具体病因是因人而异的,用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型,HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次,这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如,现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂,但在用药3-12月后常出现耐药,其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片,则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变,从而可对症下药,所以对指导治疗和预后有很大的意义。

测序            
    基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列,这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列,准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异,结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间,提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道,去年有一种不成熟的生物芯片在15分钟内完成了1.6万个碱基对的测定,96个这样的生物芯片的平行工作,就相当于每天1.47亿个碱基对的分析能力!

生物信息学研究
   人类基因组计划(HGP)是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能,只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。基因的功能并不独立的,一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变,从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了,需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系,全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息,并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的最好方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作,但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式,几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。
    由于人类基因只是地球上几十万种生物基因资源中的一份子,在今后的几十年内,人类将测出所有物种的"基因图谱"。因此,类似如人类基因组计划的基因研究和生物信息产业,还仅仅是一个起步,其将来的发展前景是无法估量的。生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台,其广阔的发展空间就不言而喻。
在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。

 


 

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