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电子显微镜及其操作

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  电子显微镜的主要组成部分是:
  电子源是一个释放自由电子的阴极,一个环状的阳极加速电子。阴极和阳极之间的电压差必须非常高,一般在数千伏到3百万伏之间。
  电子透镜用来聚焦电子。一般使用的是磁透镜,有时也有使用静电透镜的。电子透镜的作用与光学显微镜中的光学透镜的作用是一样的。光学透镜的焦点是固定的,而电子透镜的焦点可以被调节,因此电子显微镜不象光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。
  真空装置。真空装置用以保障显微镜内的真空状态,这样电子在其路径上不会被吸收或偏向。
  样品架。样品可以稳定地放在样本架上。此外往往还有可以用来改变样品(如移动、转动、加热、降温、拉长等)的装置。
  探测器,用来收集电子的信号或次级信号。

目录

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原理编辑本段回目录

是一种电子仪器设备,可用来详细研究电子发射体表面电子的放射情形。其放大倍数和分辨率都比光学显微镜高得多。因为普通光学显微镜的放大倍数和分辨率有限,无法观测到微小物体。以电子束来代替可见光束,观察物体时,分辨率就没有波长要在可见光谱之内的限制,不过电子透镜无法作得像光学透镜那样完美。因此理论上,电子显微镜所具有的分辨率并不可靠。目前电子显微镜的分辨率可达10-7厘米(约为原子直径的两倍)。通常电子显微镜的放大率是200~200 000倍,再经照相放大可达1000 000倍。电子显微镜有两大类:(1)发射型。(2)电磁、静电扫描型。前者用于研究电子放射现象;后者用以增加普通光学显微镜的应用范围。1924年法国物理学家德布洛意指出电子和其他的粒子也都具有和光类似的波动性质。他还求出了计算它们波长的公式:
λ=/(mv)
式中m是粒子的质量而v是它的速度,h是普朗克常数。此公式发明的年代较早,后来由美国科学家德维生及革末用实验证明其正确性。既然正确,也就告诉人们:虽然电子是一种可称重量,可数数目,可以被电子枪发射的粒子,但它同时又是一种波。从公式中我们可以看到,如果使电子运动的速度十分巨大的话,它就可以明显地显示出波长极短的波动性。如果在光学显微镜中被观察物的大小比光波波长还小的话,人们就不能分辨出来。在实用上通常取波长λ的三分之一作为限度,光波波长约在6×10-5厘米左右,它的三分之一就是2×10-5厘米了。然而,有很多科学家急待观察的微小东西如病毒体、胶体粒子及结晶结构的大小都在这限度以下,既然如此,如果我们把一颗运动中的电子加速,使它产生巨大的速度,从而有极短的波长,则利用此原理制成的电子显微镜就能观察到极微小的物体了。把电子加速的办法是在真空中加上若干万伏的高电压,电子就会以极快的速度射出,其波长可能会达到4×10-5厘米这样短的长度,也就是说,电子显微镜可以看到1.4×10-10cm 这样小的物体。当然这是理论上的结果,在实际上由于仪器等等原因,不可能达到这样理想的地步。但无论如何,电子显微镜已可以放大五万倍以上;而有些精良到可将物体放大十万倍。电子显微镜中有一个电子枪,电子在枪集束射出,正像光学显微镜中利用光学透镜的成像作用得到显微的放大像一样,在电子显微镜中用磁透镜,使电子束会聚成像。我们把一片待观察的物体,例如一片很薄的晶体,放在电子显微镜中,电子束就会射向这片物体上,在一块荧光幕上就会得到一个放大的影像。如果在电子显微镜中用感光的底片代替荧幕的话就可以得到一张微观世界的珍贵图片。而一些特别好的电子显微镜,甚至可以观察到一些巨分子的结构!这些图片在科学研究上的价值十分重大。当然,在电子显微镜中不会这样简单,它要涉及电子射线通过物体产生不同的散射而造成明暗不同的影响。最近,有些电子显微镜是利用电子束的反射来观察较厚的物体例如病菌、病毒及其他极微小物体的巨分子组织。而最新的显微镜用的却不是电子显微镜,而是离子显微镜借以达到更短的波长,米勒曾经利用氦的离子显微镜成功地拍摄到金属表面的单独分子运动。这种离子显微镜可以分辨原子之间相隔百万分之二十七厘米的空隙,它是目前显微镜中最好的一种。

类别编辑本段回目录

1、 透射电镜 (TEM)
样品必须制成电子能穿透的,厚度为100~2000 Å的薄膜。成像方式与光学生物显微镜相似,只是以电子透镜代替玻璃透镜。放大后的电子像在荧光屏上显示出来。图1 透射电子显微镜的光路示意图是其光路示意图。TEM的分辨本领能达 3 Å左右。在特殊情况下能更高些。
  (1)超高压电镜 (HVEM) 是一种TEM,不过常用的 TEM加速电压为 100 kV。只能穿透几千埃厚的样品。电子的穿透能力随 2 = v2/c2 ( 电子速度与光速之比 )而增。由于相对论性效应,2在 500 kV以上增加得就很慢了。目前有200 kV、300 kV和1000 kV的商品电镜。法国和日本有3000 kV的特制电镜。HVEM除加速筒以外与一般 TEM相似,只是尺寸放大了。1000 kV的电镜有两层楼高。放大尺寸后,样品周围空间增大,便于安置各种处理样品的附件,如拉伸、加热、冷却、化学反应等副件,并能把它们与倾斜样品台结合起来;还可以做动态观察,用电视记录样品处理过程中的变化。高能量的电子能造成样品中的辐射损伤,这对研究材料辐射损伤的微观机理带来极大的方便。
  (2) 高分辨电镜(HREM) 提高加速电压,使电子波长更短,能提高分辨本领。由于技术上的难度高,所以至70年代初超高压电镜主要针对提高穿透率。70年代末至80年代初技术上的提高带来了200 kV、300 kV的高分辨商品电镜及个别500 kV、600 kV和1000 kV的HREM。分辨本领能达2 Å左右。不久将能达到1.5 Å 。由于生物学分子极易被辐照损伤,所以目前HREM主要用于观察无机材料中的原子排列。
    2、扫描电镜 (SEM)
   主要用于直接观察固体表面的形貌,其原理如图2扫描电子显微镜的原理图所示。先利用电子透镜将一个电子束斑缩小到几十埃,用偏转系统使电子束在样品面上作光栅扫描。电子束在它所到之处激发出次级电子,经探测器收集后成为信号,调制一个同步扫描的显像管的亮度,显示出图像。样品表面上的凹凸不平使某些局部朝向次级电子探测器,另一些背向探测器。朝向探测器的部分发出的次级电子被集收得多,就显得亮,反之就显得暗,由此产生阴阳面、富有立体感的图像。像的放大倍数为显像管的扫描幅度比上样品面上电子束的扫描幅度。SEM的分辨本领比电子束斑直径略大。目前SEM的分辨本领能达60 Å 。
    3、扫描透射电镜(STEM)
成像方式与扫描电镜相似,不过接收的不是次级电子而是透射电子(包括部分小角散射电子)。样品也必须是薄膜,STEM的分辨本领与电子束斑直径相当。专门的STEM用高亮度场致发射电子枪(要求10-10托的超高真空)。分辨本领能达3 Å 。利用这种STEM已观察到轻元素支持膜上的单个重原子。对实际工作尤为重要的是可以利用它的微小电子束斑作极微区(几十埃)的晶体结构分析(用电子衍射)和成分分析(用电子束激发的标识X 射线或者用电子能量损失谱)。目前商品TEM可以带有STEM附件,不过因为没有高亮度场致发射枪,所以只能将束斑缩到几十埃。能做约100 Å范围内的结构和成分分析。能在观察显微像的同时在其任意一个微小的局部做上述分析的电镜叫“分析电镜”。

电子显微镜衬度(反差)的来源编辑本段回目录

 现按各种电镜分别叙述。
1、 透射电镜
TEM衬度的形成,物镜后焦面是起重要作用的部位。电子经样品散射后,相对光轴以同一角度进入物镜的电子在物镜后焦面上聚焦在一个点上。散射角越大,聚焦点离轴越远,如果样品是一个晶体,在后焦面上出现的是一幅衍射图样。与短晶面间距(或者说“高空间频率”)对应的衍射束被聚焦在离轴远处。在后焦面上设有一个光阑。它截取那一部分电子不但对衬度,而且对分辨本领有直接的影响。如果光阑太小,把需要的高空间频率部分截去,那么和细微结构对应的高分辨信息就丢失了(见阿贝成像原理)。
样品上厚的部分或重元素多的部分对电子散射的几率大。透过这些部分的电子在后焦面上分布在轴外的多。用光阑截去部分散射电子会使“质量厚度”大的部位在像中显得暗。这种衬度可以人为地造成,如生物样品中用重元素染色,在材料表面的复形膜上从一个方向喷镀一层金属,造成阴阳面等。散射吸收(指被光阑挡住)衬度是最早被人们所认识和利用的衬度机制。就表面复型技术而言,它的分辨本领可达几十埃。至于晶体样品的衍衬像和高分辨的点阵像的衬度来源,见点阵像和电子衍衬像。
2、 扫描电镜
除次级电子外,用背散射电子(经过多次散射后又从试样表面出来的入射电子)成像可辨别原子序数的差别。用标识X 射线成像可辨别元素分布。其他效应如阴极荧光、电子束诱导电流在半导体材料和器件中有其应用。用电子沟道效应可得出晶体取向信息。
扫描透射电镜与TEM之间有一个倒易关系。如果一个STEM中入射电子的孔径角与一个 TEM中出射电子的孔径角相等,STEM的出射孔径角也与TEM的入射孔径角相等,那么两者图像的反差就相同。

种类编辑本段回目录

  利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy TEM)可以直接获得一个样本的投影。在这种显微镜中电子穿过样本,因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低,样本就必须越薄。
  通过改变物镜的透镜系统人们可以直接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本的晶体结构。
  在能量过滤透过式电子显微镜(Energy Filtered Transmission Electron Microscopy,EFTEM)中人们测量电子通过样本时的速度改变。由此可以推测出样本的化学组成,比如化学元素在样本内的分布。
  扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)中的电子束尽量聚焦在样本的一小块地方,然后一行一行地扫描样本。入射的电子导致样本表面散发出电子,显微镜观察的是这些每个点散射出来的电子。由于这样的显微镜中电子不必透射样本,因此其电子加速的电压不必非常高。场发射扫描电子显微镜是一种比较简单的电子显微镜,它观察样本上因强电场导致的场发射所散发出来的电子。
  假如观察的是透过样本的扫描电子的话,那么这种显微镜被称为扫描透射电子显微镜(Scanning Transmission Electron Microscopy,STEM)。

发展历史编辑本段回目录

  电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代,透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍,而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍,所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。
  1931年,德国的M.诺尔和E.鲁斯卡,用冷阴极放电电子源和三个电子透镜改装了一台高压示波器,并获得了放大十几倍的图象,发明的是透射电镜,证实了电子显微镜放大成像的可能性。1932年,经过鲁斯卡的改进,电子显微镜的分辨能力达到了50纳米,约为当时光学显微镜分辨本领的十倍,突破了光学显微镜分辨极限,于是电子显微镜开始受到人们的重视。
  到了二十世纪40年代,美国的希尔用消像散器补偿电子透镜的旋转不对称性,使电子显微镜的分辨本领有了新的突破,逐步达到了现代水平。在中国,1958年研制成功透射式电子显微镜,其分辨本领为3纳米,1979年又制成分辨本领为0.3纳米的大型电子显微镜。
  电子显微镜的分辨本领虽已远胜于光学显微镜,但电子显微镜因需在真空条件下工作,所以很难观察活的生物,而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。其他的问题,如电子枪亮度和电子透镜质量的提高等问题也有待继续研究。

重要指标编辑本段回目录

  它与透过样品的电子束入射锥角和波长有关。可见光的波长约为300~700纳米,而电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50~100千伏时,电子束波长约为0.0053~0.0037纳米。由于电子束的波长远远小于可见光的波长,所以即使电子束的锥角仅为光学显微镜的1%,电子显微镜的分辨本领仍远远优于光学显微镜。
  电子显微镜由镜筒、真空系统和电源柜三部分组成。镜筒主要有电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件,这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体;真空系统由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成,并通过抽气管道与镜筒相联接;电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。
  电子透镜是电子显微镜镜筒中最重要的部件,它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦,其作用与玻璃凸透镜使光束聚焦的作用相似,所以称为电子透镜。现代电子显微镜大多采用电磁透镜,由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。
  电子枪是由钨丝热阴极、栅极和阴极构成的部件。它能发射并形成速度均匀的电子束,所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。
  电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构;扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌,也能与 X射线衍射仪或电子能谱仪相结合,构成电子微探针,用于物质成分分析;发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。
  投射式电子显微镜因电子束穿透样品后,再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿。在这种电子显微镜中,图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。样品较薄或密度较低的部分,电子束散射较少,这样就有较多的电子通过物镜光栏,参与成像,在图像中显得较亮。反之,样品中较厚或较密的部分,在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密,则像的对比度就会恶化,甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。
  透射式电子显微镜镜筒的顶部是电子枪,电子由钨丝热阴极发射出、通过第一,第二两个聚光镜使电子束聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜上,再通过中间镜和投影镜逐级放大,成像于荧光屏或照相干版上。
  中间镜主要通过对励磁电流的调节,放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍;改变中间镜的焦距,即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。为了能研究较厚的金属切片样品,法国杜洛斯电子光学实验室研制出加速电压为3500千伏的超高压电子显微镜。
  扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品,仅在样品表面扫描激发出次级电子。放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子,通过放大后调制显像管的电子束强度,从而改变显像管荧光屏上的亮度。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描,这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像,这与工业电视机的工作原理相类似。
  扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。放大倍数是显像管上扫描幅度与样品上扫描幅度之比,可从几十倍连续地变化到几十万倍。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品;图像有很强的立体感;能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和 X射线等信息分析物质成分。
  扫描式电子显微镜的电子枪和聚光镜与透射式电子显微镜的大致相同,但是为了使电子束更细,在聚光镜下又增加了物镜和消像散器,在物镜内部还装有两组互相垂直的扫描线圈。物镜下面的样品室内装有可以移动、转动和倾斜的样品台。

电子显微镜生物样品的制备与观察编辑本段回目录

一、电子显微镜与光学显微镜的主要区别
显微镜的分辨率取决于所用光的波长,1933年开始出现的电子显微镜正是由于使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源,使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。而光源的不同,也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异(表Ⅲ-1)。表Ⅲ-1
根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异,现代电子显微镜已发展形成了许多种类型,目前最常用的是透射电子显微镜(transmission electron microscope)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope),前者总放大倍数可在1000~1000000倍范围内变化,后者总放大倍数可在20~300000倍之间变化。本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。

二、器材
1.菌种 大肠杆菌(大肠埃希氏菌,Escherichia coli)斜面。
2.溶液或试剂  醋酸戊脂,浓硫酸,无水乙醇,无菌水,2%磷钨酸钠(pH6.5~8.0)水溶液,0.3%聚乙烯甲醛(溶于三氯甲烷)溶液,细胞色素c,醋酸铵,质粒pBR322。
3.仪器或其他用具 普通光学显微镜,铜网,瓷漏斗,烧杯,平皿,无菌滴管,无菌镊子,大头针,载玻片,细菌计数板,真空镀膜机,临界点干燥仪等。

三、操作步骤
(一)透射电镜的样品制备及观察
1.金属网的处理
光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。而在透射电镜中,由于电子不能穿透玻璃,只能采用网状材料作为载物,通常称为载网。载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格,其中最常用的是200~400目(孔数)的铜网。网在使用前要处理,除去其上的污物,否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。本实验选用的是400目的铜网,可用如下方法进行处理:首先用醋酸戊酯浸漂几小时,再用蒸馏水冲洗数次,然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。如果铜网经以上方法处理仍不干净时,可用稀释的浓硫酸(1:1)浸1~2分钟,或在1% NaOH 溶液中煮沸数分钟,用蒸馏水冲洗数次后,放入无水乙醇中脱水,待用。

2.支持膜的制备
在进行样品观察时,在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜,否则细小的样品会从载网的孔中漏出去,这层薄膜通常称为支持膜或载膜。支持膜应对电子透明,其厚度一般应低于20nm;在电子束的冲击下,该膜还应有一定的机械强度,能保持结构的稳定,并拥有良好的导热性;此外,支持网在电镜下应无可见的结构,且不与承载的样品发生化学反应,不干扰对样品的观察,其厚度一般为15nm左右。支持膜可用塑料膜(如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等),也可以用碳膜或者金属膜(如铍膜等)。常规工作条件下,用塑料膜就可以达到要求,而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易,但强度不如聚乙烯甲醛膜。
(1)火棉胶棉的制备  在一干净容器(烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗)中放入一定量的无菌水,用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液,滴一滴于水面中央,勿振动,待醋酸戊酯蒸发,火膜胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜。用镊子将它除掉,再重复一次此操作,主要是为了清除水面上的杂质。然后适量滴一滴火棉胶液于水面,火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关,待膜形成后,检查是否有皱折,如有,则除去一直待膜制好。
所用溶液中不能有水分及杂质,否则形成的膜的质量较差。待膜成型后,可以侧面对光检查所形成的膜是否平整及是否有杂质。
(2)聚乙烯甲醛膜(formvar 膜)的制备
①洗干净的玻璃板插入0.3% formvar溶液中静置片刻(时间视所要求的膜的厚度而定),然后取出稍稍晾干便会在玻璃板上便形成一层薄膜;
②用锋利的刀片或针头将膜刻一矩形;
③将玻板轻轻斜插进盛满无菌水的容器中,借助水的表面张力作用使膜与玻片分离并漂浮在水面上。
所使用的玻片一定要干净,否则膜难以从上面脱落;漂浮膜时,动作要轻,手不能发抖,否则膜将发皱;同时,操作时应注意防风避尘,环境要干燥,所用溶剂也必需有足够的纯度,否则都将对膜的质量产生不良影响。

3.转移支持膜到载网上
转移支持膜到载网上,可有多种方法,常用的有如下二种:
(1) 将洗净的网放入瓷漏斗中,漏斗下套上乳胶管,用止水夹控制水流,缓缓向漏斗内加入无菌水,其量约高1厘米;用无菌镊子尖轻轻排除铜网上的气泡,并将其均匀地摆在漏斗中心区域;按2所述方法在水面上制备支持膜,然后松开水夹,使膜缓缓下沉,紧紧贴在铜网上;将一清洁的滤纸覆盖地漏斗上防尘,自然干燥或红外线灯下烤干。干燥后的膜,用大头针尖在铜网周围划一下,用无菌镊子小心将铜网膜移到载玻片上,置光学显微镜下用低倍镜挑选完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。
(2) 按2所述方法在平皿或烧杯里制备支持膜,成膜后将几片铜网放在膜上,再在上面放一张滤纸,浸透后用镊子将滤纸反转提出水面。将有膜及铜网的一面朝上放在干净平皿中,置40℃烘箱使干燥。

4.制片
  透射电镜样品的制备方法很多,如超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法、滴液法等。其中滴液法,或在滴液法基础上发展出来的其他类似方法如直接贴印法、喷雾法等主要被用于观察病毒粒子、细菌的形态及生物大分子等。而由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等元素组成,散射电子的能力很低,在电镜下反差小,所以在进行电镜的生物样品制备时通常还须采用重金属盐染色或金属盐喷镀等方法来增加样品的反差,提高观察效果。例如负染色法就是用电子密度高,本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质(如磷钨酸钠或磷钨酸钾)来对样品进行“染色”。由于这些重金属盐不被样品万分所吸附而是沉积到样品四周,如果样品具有表面结构,这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分,因而在样品四周有染液沉积的地方,散射电子的能力强,表现为暗区,而在有样品的地方散射电子的能力弱,表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。负染色法由于操作简单,目前在进行透射电镜生物样品制片时比较常用。本实验将主要介绍采用滴液法结合负染色技术观察细菌及核酸分子的形态。
(1)细菌的电镜样品制备
①将适量无菌水加入生长良好的细菌斜面内,用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。用无菌滤纸过滤,并调整滤液中的细胞浓渡为108~109个/亳升。
②取等量的上述菌悬液与等量的2%的磷钨酸钠水溶液混合,制成混合菌悬液。
③用菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
④经3~5分钟后,用滤纸吸去余水,待样品干燥后,置低倍光学显微镜下检查,挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。
有时为了保持菌体的原有形状,常用戊二醛、甲醛、锇酸蒸气等试剂小固定后再进行染色。其方法是将用无菌水制备好的菌悬液经过过滤,然后向滤液中加几滴固定液(如pH7.2,0.15%的戊二醛磷酸缓冲液),经这样预先稍加固定后,离心,收集菌体,再用无菌水制成菌悬液,并调整细胞浓度为108~109个/毫升。然后按上述方法染色。
(2) 核酸分子的电镜样品制备(图Ⅲ-7)核酸分子链一般较长,采用普通的滴液或喷雾法易使其结构受到破坏,因此目前多采用蛋白质分子膜技术来进行核酸分子样品的制备。其原理是:很多球状蛋白均能在水溶液或盐溶液的表面形成不溶的变性薄膜,在适当的条件下这一薄膜可以成为单分子层,由伸展的肽链构成一个分子网。当核酸分子与该蛋白质单分子膜作用时,会由于蛋白质的氨基酸碱性侧链基团的作用,使得核酸从三维空间结构的溶液构型吸附于肽链网而转化为二维空间的构型,并从形态到结构均能保持一定程度的完整性。最后将吸附有核酸分子的蛋白质单分子膜转移到载膜上,用负染等方法增加样品的反差后置电镜观察。可用展开法、扩散法、一步稀释法等使核酸吸附到蛋白质单分子膜上,本实验采用展开法。图Ⅲ-7
①将质粒pBR322与一碱性球状蛋白溶液(一般为细胞色素c)混合,使浓度分别达到0.5~2 mg/ml和0.1mg/ml,并加入终浓度为0.5~1mol/L的醋酸铵和1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠,成为展开溶液,pH为7.5。
②在一干净的平皿中注入一定下相溶液(蒸馏水或0.1~0.5mol/L的醋酸铵溶液),并在液面上加入少量滑石粉。将一干净载玻片斜放于平皿中,用微量注射器或移液枪吸取50μl的展开溶液,在离下相溶液表面约1cm左右的载玻片上前后摆动,滴于载玻片的表面,此时可看到滑石粉层后退,说明蛋白质单分子膜逐渐形成,整个过程约需2~3min。载玻片倾斜的角度决定了展开液下滑至下相溶液的速度,并对单分子膜的形成质量有影响,经验证明倾斜度以150左右为宜。在蛋白形成单分子膜时,溶液中的核酸分子也同时分布于蛋白质基膜中间,并略受蛋白质肽链的包裹。理论计算及实验证明,当1mg的蛋白质展开成良好的单分子膜时,其面积约为1cm2,因而可根据最后形成的单分子膜面积的大小估计其好坏程度。如果面积过小,说明形成的膜并非单分子层,因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危险,使整个核酸分子消失或反差变坏。
在单分子膜形成时整个装置最好用玻璃罩等物盖住,以防操作人员的呼吸和旁人走动等引起气流的影响以及灰尘等脏物的污染。另外,在展开溶液中可适量加入一些与核酸量相差不过悬殊的指示标本,如烟草花叶病病毒等,以利于鉴定单分子膜的展开及后面转移的好坏。
③单分子膜形成后,用电镜镊子取一覆有支持膜的载网,使支持膜朝下,放置于离单分子膜前沿1cm或距载玻片0.5cm的膜表面上,并用镊子即刻捞起,单分子膜即吸附于支持膜上。多余的液体可用小片滤纸吸去,也可将载网直接漂浮于无水乙醇中10~30s。
④将载有单分子膜的载网置于10-3~10-5mol/L的醋酸铀乙醇溶液中染色约30s(此步可在用乙醇脱水时同时进行),或用旋转投影的方法将金属喷镀于核酸样品的表面。也可将二种方法结合起来,在染色后再进行投影,其效果有时比单独使用一种方法更好一些。

5.观察
将载有样品的铜网置于透射电镜中进行观察。

(二) 扫描电镜微生物样品的制备及观察
扫描电镜观察时要求样品必需干燥,并且表面能够导电。因此,在进行扫描电镜微生物样品制备时一般都需采用固定、脱水、干燥及表面镀金等处理步骤。

1.固定及脱水
生物样品的精细结构易遭破坏,因此在进行制样处理和进行电镜观察前必需进行固定,以使其能最大限度地保持其生活时的形态。而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醇等对样品进行梯度脱水,也是为了在对样品进行干燥处理时尽量减少由表面张力引起的其自然形态的变化。
将处理好的、干净的盖玻片,切割成4~6mm2的小块,将待检的较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上,或将菌苔直接涂上,也可用盖玻片小块粘贴菌落表面,自然干燥后置光学显微镜镜检,以菌体较密,但又不堆在一起为宜;标记盖玻片小块有样品的一面;将上述样品置于1%~2%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.2左右)中,于40C冰箱中固定过夜。次日以0.15%的同一缓冲液冲洗,用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水,每次15min。脱水后,用醋酸戊脂置换乙醇。
另一种与之类似的样品制备方法是采用离心洗涤的手段将菌体依次固定及脱水,最后涂布到玻片上。其优点是:①在固定及脱水过程中可完全避免菌体与空气接触,从而可最大程度地减少因自然干燥而引起的菌体变形;②可保证最后制成的样品中有足够的菌体浓度,因为涂在玻片上的菌体在固定及干燥过程中有时会从玻片上脱落;③确保玻片上有样品的一面不会弄错。

2.干燥
将上述制备的样品置于临界点干燥器中,浸泡于液态二氧化碳中,加热到临界点温度(31.40,72.8个大气压)以上,使之气化进行干燥。
样品经脱水后,有机溶剂排挤了水分,侵占了原来水的位置。水是脱掉了,但样品还是浸润在溶剂中,还必需在表面张力尽可能小的情况下将这些溶剂“请”出去,使样品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是临界点干燥法。其原理是在一装有溶液的密闭容器中,随着温度的升高,蒸发速率加快,气相密度增加,液相密度下降。当温度增加到某一定值时,气、液二相密度相等,界面消失,表面张力也就不存在了。此时的温度及压力即称为临界点。将生物样品用临界点较低的物质置换出内部的脱水剂进行干燥,可以完全消除表面张力对样品结构的破坏。目前用得最多的置换剂是二氧化碳。由于二氧化碳与乙醇的互溶性不好,因此样品经乙醇分级脱水后还需用与这两种物质都能互溶的“媒介液”醋酸戊脂置换乙醇。

3.喷镀及观察
将样品放在真空镀膜机内,把金喷镀到样品表面后,取出样品在扫描电镜中进行观察。

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一、扫描电子显微镜的工作原理
    扫描电镜是用聚焦电子束在试样表面逐点扫描成像。试样为块状或粉末颗 粒,成像信号可以是二次电子、背散射电子或吸收电子。其中二次电子是最主要 的成像信号。由电子枪发射的能量为 5 ~ 35keV 的电子,以其交 叉斑作为电子源,经二级聚光镜及物镜的缩小形成具有一定能量、一定束流强度 和束斑直径的微细电子束,在扫描线圈驱动下,于试样表面按一定时间、空间顺 序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用,产生二次电子发射(以及其它物 理信号),二次电子发射量随试样表面形貌而变化。二次电子信号被探测器收集 转换成电讯号,经视频放大后输入到显像管栅极,调制与入射电子束同步扫描的 显像管亮度,得到反映试样表面形貌的二次电子像。
二、扫描电镜的特点
(1) 可以观察直径为0 ~ 30mm的大块试样(在半导体工业可以观察更大直径),制样方法简单。
(2) 场深大、三百倍于光学显微镜,适用于粗糙表面和断口的分析观察;图像富有立体感、真实感、易于识别和解释。
(3) 放大倍数变化范围大,一般为 15 ~ 200000 倍,对于多相、多组成的非均匀材料便于低倍下的普查和高倍下的观察分析。
(4) 具有相当高的分辨率,一般为 3.5 ~ 6nm。
(5) 可以通过电子学方法有效地控制和改善图像的质量,如通过调制可改善图像反差的宽容度,使图像各部分亮暗适中。采用双放大倍数装置或图像选择器,可在荧光屏上同时观察不同放大倍数的图像或不同形式的图像。
(6) 可进行多种功能的分析。与 X 射线谱仪配接,可在观察形貌的同时进行微区成分分析;配有光学显微镜和单色仪等附件时,可观察阴极荧光图像和进行阴极荧光光谱分析等。
(7) 可使用加热、冷却和拉伸等样品台进行动态试验,观察在不同环境条件下的相变及形态变化等。

三、扫描电镜的主要结构
1.电子光学系统:电子枪;聚光镜(第一、第二聚光镜和物镜);物镜光阑。
2.扫描系统:扫描信号发生器;扫描放大控制器;扫描偏转线圈。
3.信号探测放大系统:探测二次电子、背散射电子等电子信号。
4.图象显示和记录系统:早期SEM采用显象管、照相机等。数字式SEM采用电脑系统进行图象显示和记录管理。
5.真空系统:真空度高于 10 -4 Torr 。常用:机械真空泵、扩散泵、涡轮分子泵
6.电源系统:高压发生装置、高压油箱。
 
四、扫描电镜主要指标
1.放大倍数 M=L/l
2.分辨率(本领)
影响分辨本领的主要因素:入射电子束斑的大小,成像信号(二次电子、背散射电子等)。
3.扫描电镜的场深
扫描电镜的场深是指电子束在试样上扫描时,可获得清晰图像的深度范围。当一束微细的电子束照射在表面粗糙的试样上时,由于电子束有一定发散度,除了焦平面处,电子束将展宽,场深与放大倍数及孔径光阑有关。

五、试样制备
1 .对试样的要求:试样可以是块状或粉末颗粒,在真空中能保持稳定,含有水分的试样应先烘干除去水分,或使用临界点干燥设备进行处理。表面受到污染的试样,要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗,然后烘干。新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以免破坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵 蚀,才能暴露某些结构细节,则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净,然后烘干。对磁性试样要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响。试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸,不能过大,样品座尺寸各仪器不均相同,一般小的样品座为Φ3~5mm,大的样品座为Φ30~50mm,以分别用来放置不同大小的试样,样品的高度也有一定的限制,一般在5~10mm左右。
2 .扫描电镜的块状试样制备是比较简便的。对于块状导电材料,除了大小要适合仪器样品座尺寸外,基本上不需进行什么制备,用导电胶把试样粘结在样品座上,即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料,要先进行镀膜处理,在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累,影响图象质量。并可防止试样的热损伤。
3 、粉末试样的制备:先将导电胶或双面胶纸粘结在样品座上,再均匀地把粉末样撒在上面,用洗耳球吹去未粘住的粉末,再镀上一层导电膜,即可上电镜观察。
4 、镀膜:镀膜的方法有两种,一是真空镀膜,另一种是离子溅射镀膜。离子溅射镀膜的原理是:在低气压系统中,气体分子在相隔一定距离的阳极和阴极之间的强电场作用下电离成正离子和电子,正离子飞向阴极,电子飞向阳极,二电极间形成辉光放电,在辉光放电过程中,具有一定动量的正离子撞击阴极,使阴极表面的原子被逐出,称为溅射,如果阴极表面为用来镀膜的材料(靶材),需要镀膜的样品放在作为阳极的样品台上,则被正离子轰击而溅射出来的靶材原子沉积在试样上,形成一定厚度的镀膜层。 离子溅射时常用的气体为惰性气体氩,要求不高时,也可以用空气,气压约为 5 X 10 -2 Torr 。离子溅射镀膜与真空镀膜相比,其主要优点是:( 1 )装置结构简单,使用方便,溅射一次只需几分钟,而真空镀膜则要半个小时以上。( 2 )消耗贵金属少,每次仅约几毫克。( 3 )对同一种镀膜材料,离子溅射镀膜质量好,能形成颗粒更细、更致密、更均匀、附着力更强的膜。

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