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  培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。
  按所用原料不同,可分为两类:应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的,称为天然培养基;应用化学药品配成并标明成分的,称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的培养基,大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管,现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在2~6。C的冰箱内。

目录

常见培养基编辑本段回目录

  1、细菌培养基
  配方一 牛肉膏琼脂培养基
  牛肉膏0.3克 ,蛋白胨1.0克,氯化钠 0.5克,琼脂 1.5克,
  水 100毫升
  在烧杯内加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2~7.6,分装在各个试管里,加棉花塞,用高压蒸汽灭菌30分钟。
  配方二 马铃薯培养基
  取新鲜牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀细细剁成肉末后,加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号,煮沸,转用文火炖2小时。过滤,滤出的肉末干燥处理,滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心,灭菌,备用。
  配方三 根瘤菌培养基
  葡萄糖 10克 磷酸氢二钾 0.5克
  碳酸钙 3克 硫酸镁 0.2克
  酵母粉 0.4克 琼脂 20克
  水 1000毫升 1%结晶紫溶液 1毫升
  先把琼脂加水煮沸溶解,然后分别加入其他组分,搅拌使溶解后,分装,灭菌,备用。
  2、放线菌培养基
  配方一 淀粉琼脂培养基(高氏培养基)
  可溶性淀粉 2克 硝酸钾 0.1克
  磷酸氢二钾 0.05克 氯化钠 0.05克
  硫酸镁 0.05克 硫酸亚铁 0.001克
  琼脂 2克 水 100毫升
  先把淀粉放在烧杯里,用5毫升水调成糊状后,倒入95毫升水,搅匀后加入其他药品,使它溶解。在烧杯外做好记号,加热到煮沸时加入琼脂,不停搅拌,待琼脂完全溶解后,补足失水。调整pH值到7.2~7.4,分装后灭菌,备用。
  配方二 面粉琼脂培养基
  面粉 60克 琼脂 20克
  水 1000毫升
  把面粉用水调成糊状,加水到500毫升,放在文火上煮30分钟。另取500毫升水,放入琼脂,加热煮沸到溶解后,把两液调匀,补充水分,调整pH值到7.4,分装,灭菌,备用。
  3、真菌培养基
  配方一 萨市(Sabouraud’s)培养基
  蛋白胨 10克 琼脂 20克
  麦芽糖 40克 水 1000毫升
  先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40克麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使它溶解,然后分装,灭菌,备用。
  本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。
  配方二 马铃薯糖琼脂培养基
  把马铃薯洗净去皮,取200克切成小块,加水1000毫升,煮沸半小时后,补足水分。在滤液中加入10克琼脂,煮沸溶解后加糖20克(用于培养霉菌的加入蔗糖,用于培养酵母菌的加入葡萄糖),补足水分,分装,灭菌,备用。
  把这培养基的pH值调到7.2~7.4,配方中的糖,如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。
  配方三 黄豆芽汁培养基
  黄豆芽 100克 琼脂 15克
  葡萄糖 20克 水 1000毫升
  洗净黄豆芽,加水煮沸30分钟。用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后放入糖,搅拌使它溶解,补足水分到1000毫升,分装,灭菌,备用。
  把这培养基的pH值调到7.2~7.4,可用来培养细菌和放线菌。
  配方四 豌豆琼脂培养基
  豌豆 80粒 琼脂 5克
  水 200毫升
  取80粒干豌豆加水,煮沸1小时,用纱布过滤后,在滤液中加入琼脂,煮沸到溶解,分装,灭菌,备用。
  4、食用菌菌种培养基
  配方一 马铃薯—蔗糖--琼脂培养基
  20%马铃薯煮汁 1000毫升
  蔗糖 20克 琼脂 18克
  把马铃薯洗净去皮后,切成小块。称取马铃薯小块200克,加水1000毫升,煮沸20分钟后,过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升,即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖,煮沸,使它溶解后,补足水分,分装,灭菌,备用。使用该培养基对pH值要求不严格,可以不测定。
  配方二 综合马铃薯培养基
  20%马铃薯煮汁 1000 毫升
  磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克
  葡萄糖 20克 维生素 10毫克
  琼脂 18克
  先配制20%马铃薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各种组分,加热溶解后补足水分,调整pH值到6。分装,灭菌,备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。
  5.烟草的培养基
  在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽
  CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化
  愈伤组织诱导培养基制备
  以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中.
  烟草叶片愈伤组织诱导
  取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解
  剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种
  5小片,一共接种6瓶.接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同
  样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观
  察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率.
  器官分化及植株再生培养
  将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况.
  愈伤组织诱导的总体情况
  烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而
  未形成愈伤的情况.具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发
  生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为
  60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中,外植
  体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整
  个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小.
  培养基还有:1640培养基

特殊培养基编辑本段回目录

  一 选择性培养基
  1酵母菌富集培养基
  葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05%
  孟加拉红0.003% pH4.5
  2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌
  甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02%
  二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5%
  二 鉴别培养基
  EMB培养基,常用于鉴别E.coli
  蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g
  蒸馏水1000g pH7.2
  分离海洋微生物的培养基配方
  2216E培养基配方(固体培养基)
  蛋白胨 5克
  酵母膏 1克
  磷酸高铁 0.01克
  琼脂 15-----20克
  陈海水 1000毫升
  煮沸氢氧化纳(5%)的溶液调PH值7.6—7.8
  其他培养基:
  1.高氏一号培养基
  KNO3:1g,
  NaCl:0.5g,
  K2HPO4:0.5g
  MgSO4·7H2O:0.5g
  FeSO4·7H2O:0.01g
  可溶性淀粉20g
  琼脂20g
  蒸馏水1000ml
  pH调至7.2~7.4,121°C灭菌30min
  制法:先用少量水将淀粉调成糊状,再取700ml水在电炉上加热煮沸
  然后边搅拌便将淀粉糊倒入,同时保持沸腾。然后再将其他成分加入,
  溶解后补足水分至1000ml
  肉汤蛋白胨斜面:
  蛋白胨10g
  牛肉膏5g
  蒸馏水1000ml
  NaCl:5g
  pH:7.0~7.2,121℃灭菌20min
  如配制固体培养基需加琼脂1.5%~2%,半固体培养基可加琼脂0.5%~0.8%

天然细胞培养基编辑本段回目录

  天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
  血清种类
  目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
  牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
  血清的主要成分
  血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
  血清主要作用
  1. 提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。
  2. 提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
  3. 提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
  4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
  5. 对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。
  血清培养基主要问题
  1. 血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难。
  2. 血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制。
  3. 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。
  4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。
  5. 动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。
  6. 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
  7. 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
  血清的质量标准
  血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:
  1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
  2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
  3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。
  4. 血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。
  5. 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。
  6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。
  我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。

细胞培养基的发展态势编辑本段回目录

    细胞培养基从早期的鸡胚汁发展到天然培养基,到合成培养基,再到现在的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基、限定化学成分培养基,经过近百年的历史,虽然还存在需要解决的问题,但已经发生质的飞跃。
天然培养基如蛋白水解物、血清等。其优点是含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质,渗透压、pH等也与体内环境相似。但是天然培养基在使用过程中存在诸多缺点:
1.批间差异  血清是一种成分复杂而且不确定的混合物,不同来源的血清成分存在很大的差异,因此支持细胞生长的效果也有较大差别。
2.动物来源成分  血清来源于动物,所以有可能携带传染源,包括病毒和有毒物质,任何一种传染源都有可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险;不同来源的血清存在某些特异性病毒抗体(比如:乙脑抗体、牛腹泻性病毒抗体等),直接影响接毒后病毒的复制,可能导致不产毒或毒价偏低,从而给疫苗生产造成巨大损失。  
3.提高生产成本  目前市场销售的血清平均价格约0.25元/ml,按10%添加量计算,1L培养液中血清所占的成本是25元,培养基及其他添加物的成本约为6元,每升培养液的成本中血清约占80%,由此可见血清在疫苗生产中占据了大量的生产成本。
4.血清蛋白引起的疫苗纯化问题  由于血清含有大量的不同分子量的未知蛋白和多肽类物质,势必会增加提取、分离、纯化的步骤,增加了下游纯化处理的难度,因此在疫苗纯化阶段给纯化工作带来很大的困难;疫苗产品中牛血清白蛋白残留量要求不高于50ng/剂,为达到纯化的目的,纯化工艺不得不添加新的仪器设备;在除去牛血清白蛋白残留的同时,也会损失大量的有效目的产物,从而降低了疫苗的产率;牛血清中的某些蛋白与目的产物的分子量接近,在纯化过程中不能完全被去除,由于血清残留而导致的生物制品不合格,或者因为杂蛋白含量大造成严重不良反应的情况时有出现.因此也会严重影响疫苗产品的质量。
5.相关法规对牛血清使用的规定  为了使与传染源相关的风险降到最低,国际上存在多个国家之间限制进出口生物材料的国际法规;美国、欧盟和日本等发达国家和地区计划在2010年全面停止血清在生物制药中的应用;FDA目前已不受理利用血清进行细胞培养的新药申报;FDA与美国农业部已经严密控制胎牛血清在细胞培养中的使用;2003年4月,Vera Baumans和Jan van der Valk组织召开题为“改进体外培养技术方法,替换胎牛血清”的会议,讨论FBS的使用问题,在全球范围内号召减少FBS的使用 ;因此,预计政府部门对牛血清加工或使用的限制将会更加严厉。
正是由于这些缺点,使其成为生物制品生产水平达到最优化和实现经济性目标的一大障碍,因而逐渐被合成培养基及无血清培养基所取代。合成培养基可维持细胞体外长期生存,其组成成分明确,便于精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况,便于控制和调整实验设计并使培养条件标准化。合成培养基的应用,推动了组织培养的发展。通过对细胞生长营养需求以及对生物制品生产要求的认识,已经有生物公司开发了无动物组分、能够替代水解乳蛋白欧(汉)氏平衡盐溶液的替代天然培养基,可用于地鼠肾细胞、BHK21细胞、鸡胚细胞、鸡成纤维细胞及牛睾丸细胞等细胞的生长或培养。
    但是合成培养基一般需要与大量血清配合使用,同样存在由血清引起的各种问题。在血清还不能被完全取代的情况下,需要考虑的是如何减少其使用量。为此国内已有研究人员开发出了营养丰富的低血清培养基,对于一些贴壁型细胞,不论在转瓶还是微载体反应器中培养,使用低血清培养基可以有效降低培养液中的牛血清使用量,并能提高细胞密度及生物制品的产率。细胞在低血清培养基的生长情况甚至优于加入10%牛血清的传统培养基,且能提高细胞密度、提高病毒滴度。低血清细胞培养基可用于培养VERO细胞生产狂犬疫苗、乙脑疫苗,培养BHK21细胞生产口蹄疫等疫苗。
    可见使用低血清培养基能明显降低生产成本,减少生物制品纯化损失,提高产品收率;减少由于不确定蛋白或血清组分带来干扰和差异的风险,提高生物制品的安全性;并且由于血清用量和批次的减少,从而降低了批间差的影响。
    利用生物反应器进行全悬浮、无血清细胞培养生产疫苗等生物制品,是生物制药技术的发展方向。无血清培养基完全采用人工合成的化合物,是成分确定的培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰,使实验结果更为可靠;可能发现一些在有血清培养中不容易发现的因子,如细胞生长调节因子、激素等。而细胞生长调节因子的研究又为无血清培养提供理论依据。在生物制品的生产中应用无血清培养,可提高生物制品的质量、纯度,方便产物的分离纯化,减少由血清带来的污染机会,减少过敏源,同时也减少了成本,也便于在生物反应器中进行代谢流分析,实施在线过程监控,精确投料。另外在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍。多种细胞可在无血清供应的情况下生长,尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等。
    随着人们对生物制品安全性及产率要求的提高,培养基的优化及个性化已成为趋势。如没有添加蛋白,仅包含一些动物或植物来源的成分(如低分子量肽的各种水解物)的无蛋白培养基;不包含任何蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均有已知的化学结构的化学限定培养基以及依据生物制药企业的要求定制的个性化培养基。个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用,世界著名的生物制药公司多和培养基企业合作,研制最适合自身需要的个性化细胞培养基。

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