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基因工程

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  基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 所谓基因工程(genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新技术。
  基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说,基因工程是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中"安家落户",进行正常复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 这个定义表明,基因工程具有以下几个重要特征:首先,外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖,能够跨越天然物种屏障,把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中,而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系,这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是,一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增,这样实现很少量DNA样品"拷贝"出大量的DNA,而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞DNA的技术称为“基因系治疗”(germlinetherapy),通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何,改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。 
  随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前,特别是当人们了解到遗传密码是由 RNA转录表达的以后,生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密,而是开始跃跃欲试,设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去,将DNA重新组织一下,就可以按照人类的愿望,设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型,这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计,按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”,“组装”成新的基因组合,创造出新的生物。这种完全按照人的意愿,由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术,就称为“基因工程”,或者说是“遗传工程”。

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基因工程的基本操作步骤编辑本段回目录

  1.获取目的基因是实施基因工程的第一步。
  2.基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。
  3.将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。
  4.目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。
  基因工程的前景科学界预言,21世纪是一个基因工程世纪。基因工程是在分子水平对生物遗传作人为干预,要认识它,我们先从生物工程谈起:生物工程又称生物技术,是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术,利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工,提供大量有用产品的综合性工程技术。
  生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品,例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料,还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。
  生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程等5个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造,利用生物生产人们想要的特殊产品。随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前,生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密,而是开始跃跃欲试,设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。
  美国的吉尔伯特是碱基排列分析法的创始人,他率先支持人类基因组工程 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去,将DNA重新组织一下,不就可以按照人类的愿望,设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型吗?这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同,它很像技术科学的工程设计,即按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”,“组装”成新的基因组合,创造出新的生物。这种完全按照人的意愿,由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术,就被称为“基因工程”,或者称之为“遗传工程”。
  人类基因工程走过的主要历程怎样呢?1866年,奥地利遗传学家孟德尔神父发现生物的遗传基因规律;1868年,瑞士生物学家弗里德里希发现细胞核内存有酸性和蛋白质两个部分。酸性部分就是后来的所谓的DNA;1882年,德国胚胎学家瓦尔特弗莱明在研究蝾螈细胞时发现细胞核内的包含有大量的分裂的线状物体,也就是后来的染色体;1944年,美国科研人员证明DNA是大多数有机体的遗传原料,而不是蛋白质;1953年,美国生化学家华森和英国物理学家克里克宣布他们发现了DNA的双螺旋结果,奠下了基因工程的基础;1980年,第一只经过基因改造的老鼠诞生;1996年,第一只克隆羊诞生;1999年,美国科学家破解了人类第 22组基因排序列图;未来的计划是可以根据基因图有针对性地对有关病症下药。
  人类基因组研究是一项生命科学的基础性研究。有科学家把基因组图谱看成是指路图,或化学中的元素周期表;也有科学家把基因组图谱比作字典,但不论是从哪个角度去阐释,破解人类自身基因密码,以促进人类健康、预防疾病、延长寿命,其应用前景都是极其美好的。人类10万个基因的信息以及相应的染色体位置被破译后,破译人类和动植物的基因密码,为攻克疾病和提高农作物产量开拓了广阔的前景。将成为医学和生物制药产业知识和技术创新的源泉。美国的贝克维兹正在观察器皿中的菌落,他曾对人类基因组工程提出警告。
  科学研究证明,一些困扰人类健康的主要疾病,例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症等都与基因有关。依据已经破译的基因序列和功能,找出这些基因并针对相应的病变区位进行药物筛选,甚至基于已有的基因知识来设计新药,就能“有的放矢”地修补或替换这些病变的基因,从而根治顽症。基因药物将成为21世纪医药中的耀眼明星。基因研究不仅能够为筛选和研制新药提供基础数据,也为利用基因进行检测、预防和治疗疾病提供了可能。比如,有同样生活习惯和生活环境的人,由于具有不同基因序列,对同一种病的易感性就大不一样。明显的例子有,同为吸烟人群,有人就易患肺癌,有人则不然。医生会根据各人不同的基因序列给予因人而异的指导,使其养成科学合理的生活习惯,最大可能地预防疾病。

基因工程

基因工程的工具酶 编辑本段回目录

(一)DNA限制性内切酶 

早在20世纪50年代Arber W就已发现大肠杆菌对付噬菌体和外来DNA的限制系统,及至60年代才证明存在修饰酶和限制性内切酶。这两类酶组成的细胞限制系统的生物学功能是对付外来DNA入侵的,其中修饰酶是修饰宿主自身的DNA,使之打上标记,避免自身的DNA被限制性内切酶分解;限制酶的作用是降解外来的DNA,自身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。 

修饰-限制酶主要有三类。 

1.类型I酶 

类型I酶为多亚基双功能酶,对DNA的甲基化和切割由同一种酶来完成。由3种亚基S、M、R组成:①S亚基为识别亚基,可以识别夹着一定任意碱基对长度两边的特定序列。例如Eco B识别序列为TGAN8TGCT,即识别一端为TGA,另一端为TGCT,中间夹着8个任意碱基的序列;Eco K识别AACN6GTGC。②M亚基具有甲基化酶活性,甲基由S-腺苷蛋氨酸(SAM)提供。③R亚基具有限制酶活性,可在远离识别位点1kb以上处随机进行切割。 

如果DNA两条链都已甲基化,类型I酶不对其进行切割;如果只有一条链甲基化,那么类型I酶使另一条链甲基化;如果两条链都未甲基化,则发生切割作用,使DNA变成短的碎片。类型I酶的切割是随机的,因此这类酶在基因工程中无实际用途。 

2.类型II酶 

与类型I酶不同,类型II酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成:甲基化酶和限制性内切酶,其中甲基化酶由一条肽链构成,限制酶由二条肽链构成。类型II酶的识别位点为4~6bp的回文结构,回文结构是诸如“上海自来水来自海上”的结构,其顺读和反读都是相同的。和类型I酶相同,类型II酶只对2条链都没有甲基话的DNA进行切割,对1条链甲基化的使另一条链甲基化,2条链都甲基化的不发生作用。

类型II酶的切割位点在识别序列内或识别位点附近。切割产生两种可能的末端,平头末端和粘性末端。在进行基因重组时,染色体DNA与质粒用相同的内切酶处理,产生可以相互粘合的DNA片段和质粒缺口,经DNA连接酶作用可将二者重新组装成为带有目的基因的质粒。 

互补性粘性末端之间碱基配对促使连接反应容易进行。平端之间连接反应效率很低,提高DNA连接酶和DNA片段浓度等措施可以使反应效率增强,也可以在平端上添加一段限制性内切酶的识别序列,然后经酶切产生粘性末端的办法提高接合效率。 

类型II酶是基因工程中主要的限制酶。 

3.类型III酶 

类型III酶为2个亚基的双功能酶,M亚基负责识别与修饰,R亚基负责切割。切割位点在识别序列下游24~26bp处。 

(二)DNA连接酶 

DNA连接酶的作用是将DNA相容末端彼此连接。实验室常用的连接酶为T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶既可以连接粘性末端,也可以连接平端;大肠杆菌DNA连接酶只能连接平端。因此,T4噬菌体DNA连接酶更加常用。 

(三)其他酶 

除上面2种主要的酶外,基因工程常用的酶还有DNA聚合酶(合成DNA片段)、逆转录酶(用mRNA逆转录生成DNA)等多种酶。

载体编辑本段回目录

  借助限制酶可切出含有目的基因序列的DNA片段。将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载体(vector),载体通常由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成。

  质粒是染色体外自主复制的遗传因子,多为闭环DNA分子,天然存在于细菌、真菌细胞内,质粒可以自发地从一个细菌迁移进入另一个细菌。宿主细胞指的是目的基因进行克隆的细胞,例如人的生长激素基因导入大肠杆菌进行克隆,大肠杆菌细胞就是生长激素基因的宿主细胞。如果目的基因的宿主是细菌或真菌,通常用质粒做目的基因的载体,特殊情况下用噬菌体做载体;如果宿主细胞是动植物,载体通常选取病毒或染色体DNA构建。我们把经过改造完成的能运送目的基因的载体称为克隆载体。

  作为克隆载体最基本的要求是:①具有自主复制能力,否则目的基因就无法进行克隆;②携带易于筛选的选择标记,用于筛选成功的重组DNA,淘汰未重组的空载体;③载体应尽可能小,便于导入细胞和进行繁殖;④使用安全。

  迄今为止,已经通过天然质粒、病毒等构建了多种克隆载体,例如1977年Boliver等从天然质粒出发,经删除、融合、转座及重排等操作,构建成功了适合多种用途至今仍广泛使用的克隆载体pBR322,它全长4361bp,含两个抗性基因,用于重组后的筛选,具有天然质粒的复制起始点。如果目的基因较大,需要构建病毒克隆载体,常见的是λ噬菌体克隆载体。 

  在基因操作过程中使用运载体有两个目的:一是用它作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞中去;二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类:一类是细菌细胞质的质粒,它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1~200 kb左右,kb为千碱基对),有的一个细菌中有一个,有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移,可以独立复制,也可整合到细菌染色体DNA中,随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体,如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。
  对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求:
  ①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力。
  ②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好。
  ③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。
  ④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作。
  ⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。
  常用的载体有质粒,噬菌体和病毒等。
  一、质粒载体
  质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的,能自主复制的,与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下:
  ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA(covalently closed circuar DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300 kb之间,<15kb的小质粒比较容易分离纯化,>15kb的大质粒则不易提取。
  ②能自主复制,是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类:严紧控制(stringent control)型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联,拷贝数较少,每个细胞中只有1个到十几个拷贝;另一类是松弛控制(relaxed control)型质粒,其复制宿主不偶联,每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制,不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制,称为附加体,例如细菌的性质粒就是一种附加体,它可以质粒形式存在,也能整合入细菌的DNA,又能从细菌染色质DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation),通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。
  ③质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体,线粒体DNA也是环状双链分子,也有独立复制的调控,但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分,质粒也往往有其表型,其表现不是宿主生存所必需的,但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存,例如,细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因,如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因,这种质粒称为抗药性质粒,又称R质粒,带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的,而是共生的。医学上遇到许多细菌的抗药性,常与R质粒在细菌间的传播有关,F质粒就能促使这种传递。
  现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒,而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发,人们设计了各种不同的类型的质粒载体,近年来发展很快,新的有特定用途的质粒不断被创建。图1给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱,此质粒的复制起点处序列经过改造,能高频率起动质粒复制,使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个;质粒携带一个抗氨芐青霉素基因,编码能水解β-内酰胺环,从而被坏氨芐青霉素的酶,当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中,凡不含pUC19者都不能生长,结果长出的细菌就是都含有pUC19的;pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码,β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落,当培养基中含有诱导物IPTG(isopropyl-thiogalactoside异丙基-硫代半乳糖苷)和Xgal(5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)时,lacZ ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性(质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性,两都融为一体而具酶活性,称为α-互补,α-complementation),半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色;在lacZ '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列,其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点,使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置,当外来序列插入后则破坏了lacZ '编码的半乳糖苷酶活性,生长的菌落就呈白色,这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落,称为蓝白筛选法。
  除常用的大肠杆菌质粒载体外,近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体(shuttle vectors)。
  二、噬菌体载体
  噬菌体(phage)是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,加入λ噬菌和T噬菌体等;有的则较小,如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
  λ噬菌体由头和尾构成,其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子,组装在头部蛋白质外壳内部,其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时,通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌,而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链,可以两种不同的方式繁殖(图2):①溶菌性方式(lytic pathway):在营养充足,条件适合细菌繁殖时,利用宿主菌中的酶类和原料,λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质,λDNA经多次复制合成许多子代λDNA,于是装配成许多子代的λ噬菌体,最后裂菌,释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式(lysogenic pathway):进入细菌的λDNA可整合(integrate)入细菌的染色质DNA中,随细菌染色体DNA复制,传给细菌后代,这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage),含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的,原噬菌体可从宿主DNA中切出,进入溶菌性方式的繁殖。
  λ噬菌体整个基因组如图3所示,可分为三个部分,①左臂:从A到J长约20kb,其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段:长约20kb,是λDNA整合和切出,溶原生长所需的序列。③右臂:长约10kb,是调控区,控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列;对溶菌生长来说,中段是非必需的。
  利用λ噬菌体作载体,主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列,使其随左右臂一起包装成噬菌体,去感染大肠杆菌,并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的,主要的改造是:①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大,序列中的限制性酶切点过多,妨碍其应用。②在中段非必需区,替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列,和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体;一类是插入型载体,可将外来序列插中段,常用的λgt系列载体,一般容许插入5-7kb外来DNA;另一类是转换型载体,即可用外来DNA替代中段,如IMBL系列载体。
  插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的,当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时,包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA,这比质粒载体能插入的DNA长得多;而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多,所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
  如果将左右臂和中段都去除,仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列,再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等,就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA,然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体,感染大肠杆菌后,粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。
  三、动物病毒载体
  质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖,不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多,因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆,然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40(Simian Virus 40)、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等,使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等(见后)。
  人基因组十分庞大,约含4×109bp,建立和筛选人的基因组文库,要求有容量更大的载体,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒(telesome)、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列,可插入长度达200-500kb的外源DNA,导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆,成为人基因组研究计划的重要。

  选择克隆载体的宿主细胞时通常要满足下列条件:①易于接受外源DNA;②宿主细胞必须无限制性内切酶;③宿主细胞应易于生长和筛选;④宿主细胞应无重组能力;⑤符合安全标准。

工程运载体编辑本段回目录

  目的基因在经过体外改造后,必须进人受体细胞内才能进行扩增和生物表达。但是用于DNA重组体的目的基因,不能直接引人受体细胞。因为每种生物都是长期进化的产物,具有很强的排他性。外源DNA如果单独进人受体细胞,必将被破坏。因此,必须有一种运载基因的载体作媒介物,才能达到目的。载体在基因工程中的作用,就像过河时必须有船一样。载体运载外源DNA进人受体细胞,是通过在载体自身的DNA核酸序列中插人外源DNA,再进人受体细胞内进行复制,在载体DNA复制时,外源DNA分子也获得了扩增和表达。
  目前经常使用的载体,有质粒和病毒两类。各种不同的载体,尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异,但是作为载体,它们应该具备一些共同的特性:
  1.能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA插人外源基因后,仍然保持稳定的复制状态和遗传特性;
  2.易于从宿主细胞中分离,并进行纯化;
  3.在其DNA序列中,具有适当的限制性内切酶位点。这些位点位于DNA复制的非必需区内,可在这些位点上插人外源DNA,但不影响载体自身DNA的复制;
  4.具有能够观察的表型特征,在插入外源DNA后,这些表型特征可以作为重组DNA的选择标志。
  质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子,是在细菌细胞分裂时能稳定传递给子代的遗传因子。由于细菌是一种简单的生物,对自身活动调控的机制并非绝对完美无缺,于是它为人们巧妙施用基因偷换术提供了可能。因此,我们可以借助于质粒,将基因或基因群带人细菌细胞并使其遗传信息得以表达,改变或修饰寄主细菌原有的代谢产物或产生新的物质。大肠杆菌和它的质粒DNA是DNA重组技术中最理想的载体系统,常常用来做建立基因的基因库或当作有用物质的生产车间。
  除了质粒之外,细菌病毒,也就是噬菌体病毒等也可以作为载体。但是,质粒和病毒在作为基因工程载体时是有所区别的。利用病毒作为基因运载体时,所带的基因一般还需要转到受体细胞的染色体DNA中去,才能成为稳定的结构。质粒的情况也可以是这样,但大多数情况下不是如此。质粒一旦带有人所需要的新基因,它本身就可能成为一种稳定的重组DNA。进人受体细胞后,它多半不需要把所带的基因转到受体细胞的染色体上去,这样的质粒就会进行自我复制,异源性DNA也得到了复制。这就是利用质粒作为基因运载体表现优越的地方。所以目前进行的基因工程操作,多用质粒作为基因的运载体。

自杀载体编辑本段回目录

  自杀载体是指能在一种宿主内复制但在另一宿主中却不能的质粒或噬菌体。自杀载体的一种简单形式是窄宿主范围质粒,例如那些基于CloE1样复制子的质粒。这类质粒只能在肠杆菌及关系很近的菌种中复制。其它形式的条件性复制载体有一个温度敏感复制子,或在必需基因内有一无义突变。自杀质粒应具备三个条件:⑴自杀质粒在受体菌内不能复制。⑵自杀质粒必须带有一个在整合到染色体内以后,可供选择的抗性标记。⑶自杀性质粒带有易于克隆的多克隆位点。除一些特殊构建的用于G-的自杀质粒外,对于那些易于转化的G+而言,稍加改造的用于G-的质粒就可用作自杀质粒,因为G-的质粒在G+中不能复制。因此只需在一些G-的质粒上加上能在G+中表达的抗性基因即可。保证了以上几点,自杀载体完全可以自己构建,但是在构建时,要注意以下方面:1、连接质粒载体和DNA插
  入片断时:(1)初次实验的可以建立几种不同的连接体系,比如插入片段与载体分子数比率可以为3:1,1:1,或1:3。(2)可以尝试三种温度和时间的连接如4度,过夜;15度,4-6小时;25度,1小时。2、细菌转化和筛选时:(1)如果是感受态细胞,-80度储存的在5-6周后,转化率低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力;(2)用无DNA
  转化物的感受态细菌铺板,如果有菌落生长,说明其中抗生素浓度不够。这种方法使用的载体是条件性复制载体:能够在供体菌中复制,不能在受体菌中复制。

腺病毒载体编辑本段回目录

  腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,在自然界分布广泛,至少存在100种以上的血清型。其基因组长约36kb,两端各有一个反向末端重复区(ITR),ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(E1、E2、E3、E4)承担调节功能,以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子,早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此,E1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。E3为复制非必须区,其缺失则可以大大地扩大插入容量。
  目前的腺病毒载体大多以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础。典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源基因的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包装信号φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能复制,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组,同样不能复制。外源目的基因插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似,具有同样的感染力进入靶细胞的能力,但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代,即进入靶细胞后病毒不能复制,但可以表达目的蛋白。
  一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体,此类型载体可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应,表达外源基因时间短。E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免疫反应较弱其载体容量和安全性方面亦改进许多。第三代腺病毒载体则缺失了全部的(无病毒载体,gutless vector)或大部分腺病毒基因(微型腺病毒载体,mini Ad),仅可保留ITR和包装信号序列。第三代腺病毒载体最大可插入35kb的基因,病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少,载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达,并增加了载体的稳定性。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
  腺病毒载体转基因效率高,体外实验通常接近100%的转导效率;可转导不同类型的人组织细胞,不受靶细胞是否为分裂细胞所限;容易制得高滴度病毒载体,在细胞培养物中重组病毒滴度可达(10E+11)/ml;进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组,仅瞬间表达,安全性高。因而,腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用,成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

反转录病毒载体编辑本段回目录

  反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5'—LTR和3'—LTR),有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列ψ+,同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内,这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体在构建时,删去了poi、env基因和gag基因的3’端,但保留了病毒颗粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高载体的安全性,防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样,在制备反转录病毒载体时,就必须有一个辅助细胞系,这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白,但自身没有包装信号。这样,反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病载体多半用于基因治疗,由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入,人们担心会引起不安全的后果,这种载体还在不断改进之中。

pEGFP-N1载体编辑本段回目录

  pEGFP-N1载体为真核细胞表达载体,具有对方面的优点。
  GFP的相关知识:
  绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria, 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质,由238个氨基酸组成,分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定,用甲醛固定后会持续发出荧光,但在还原环境下荧光会很快熄灭。
  与以往常用的报告基因相比,GFP具有以下优点:
  ①在荧光显微镜下,用波长约490 nm的紫外线激发后,即可观察到绿色荧光,直接、简捷、便于检测;
  ②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响,保证了极高的检出率;
  ③蛋白本身性质稳定;
  ④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性;
  ⑤其基因片段长度较小(约717 bp),易于构建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持荧光激发活性,为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
  EGFP是一种优化的突变型GFP,使其产生的荧光较普通GFP强35倍,大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子,而且其N及C端均可融合,并不影响其发光。
  pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因,如上图质粒图谱所示。
  pEGFP-N1载体具有以下几方面特点:
  ①从结构上看,该质粒具有很强的复制能力,可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞,这是保证目的基因稳定表达的因素之一;
  ②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV,可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达;
  ③具有多克隆位点,便于目的基因的插入;
  ④该载体具有neo基因,可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
  这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

pEGFP-N2编辑本段回目录

  pEGFP-N2载体为真核细胞表达载体。
pEGFP-N2载体特点:
  ①从结构上看,该质粒具有很强的复制能力,可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞,这是保证目的基因稳定表达的因素之一;
  ②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV,可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达;
  ③具有多克隆位点,便于目的基因的插入;
  ④该载体具有neo基因,可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
  这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。
  pEGFP-N2载体上携带有EGFP蛋白表达基因,如上图质粒图谱所示。
GFP的相关知识:
  绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria,是Shimomura等于1962年发现的蛋白质,由238个氨基酸组成,分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定,用甲醛固定后会持续发出荧光,但在还原环境下荧光会很快熄灭。
  与以往常用的报告基因相比,GFP具有以下优点:
  ①在荧光显微镜下,用波长约490 nm的紫外线激发后,即可观察到绿色荧光,直接、简捷、便于检测;
  ②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响,保证了极高的检出率;
  ③蛋白本身性质稳定;
  ④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性;
  ⑤其基因片段长度较小(约717 bp),易于构建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持荧光激发活性,为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
  EGFP是一种优化的突变型GFP,使其产生的荧光较普通GFP强35倍,大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子,而且其N及C端均可融合,并不影响其发光。

酵母人工染色体(Yeast artificial chromosomes YACs)编辑本段回目录

  YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体的复制元件构建的载体,其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形,生长的代时为 90 分钟;含 16 条染色体,其大小为 225-1900kb ,总计有14×106 bp;具真核 mRNA 的加工活性。
  1.YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因
  在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的,因此其在工作状态也是线状的。但是,为了方便制备YAC载体, YAC 载体以环状的方式存在,并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记,以便保存和增殖。
  YAC 载体的复制元件是其核心组成成分,其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列(autonomously replicating sequence, ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 (centromere , CEN)和两个端粒(TEL)。
  YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要,必须含有以下元件:
  ·端粒重复序列(telomeric repeat , TEL):定位于染色体末端一段序列,用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解,以形成稳定的结构。
  ·着丝粒(centromere , CEN):有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点, 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
  ·自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS) 一段特殊的序列,含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
  YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等,以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时,可抑制 ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。
  2.YAC 载体的工作原理
  YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库,特别用来构建高等真核生物的基因组文库,并不用作常规的基因克隆。图3-26是 pYAC4 的遗传结构图,当用 BamHⅠ 切割成线状后,就形成了一个微型酵母染色体,包含染色体复制的必要顺式元件,如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配,从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体,当用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂,与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体,通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制,并随细胞分裂分配到子细胞中去,达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活,从而形成红色菌落; 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb,有的可达 1Mb 以上,甚至达到 2Mb 。
  YAC 载体功能强大,但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面:首先,在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 (deletion) 和基因重排 (rearrangement) 的现象。其次,容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%~50% 。最后, YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近,影响了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞,由于其大小与内源的染色体的大小相近,就很难从中分离出来,不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是,酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外, YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子,大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中,进行功能研究。

巴斯德毕赤酵母表达系统 编辑本段回目录

 十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白(SCP),有很好的发酵基础,菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源,廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长,其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能,可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态,而在培养液中加入甲醇后,外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器,其中大量合成过氧化物酶,因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中,可免受蛋白酶的降解,且不对细胞产生毒害。
  巴斯德毕赤酵母的载体是整合型载体。常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶—1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和3'AOX1),它们被多克隆位点(MCS)分开,外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时,它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上,外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
  与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似,构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下:(1)经典遗传学操作方法(如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析);(2)分子遗传学方法(如DNA转化、基因置换等。)为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株,巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。与自主复制的质粒型表达载体不同,整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。多拷贝表达菌株的获得方式有两种。一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中,而后再通过交换整合到受体染色体上。在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。
  经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子,其产物的表达水平不同。即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。转化子的表达情况也不近相同。因此,为了获得高产量的表达菌株,需要对大量的转化子进行筛选。小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况,使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中,培养液的pH值无法控制,培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验,仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件,使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。
  巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件包括:适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值,以降低蛋白酶的活性;最大的通气量;添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。在甘油作碳源的培养液中,细胞迅速生长,菌体密度逐渐增大,但此时外源基因的表达被完全抑制。而当甘油缺失或被完全消耗时,甲醇被添加到培养液中,诱导产生外源蛋白。此阶段菌群生长迟缓,但产物表达旺盛。
  巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白,而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。当然,利用外源蛋白本身的信号序列很方便,因为基因的全部编码序列可以插入到表达载体的单个或多个克隆位点。但在许多例实验中,巴斯德毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌,如鼠表皮生长因子,产量达0.45g/L。

甲醇酵母表达系统编辑本段回目录

  甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母,主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种,其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。与以往的基因表达系统相比,它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。
  1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
  目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一,但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10~100倍。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L,而在甲醇酵母中为450mg/L,提高了60倍。椐报道,外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L。
  2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素
  2.1 表达载体 首先,甲醇酵母中没有稳定的质粒,所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子,醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%,所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次,在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体,一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷,另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解,pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外,使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体,形成多个表达单元,产生高产的菌株,此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
  2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时,甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,诱导基因表达,使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件,细胞干重达100g/L以上,蛋白质产量极高。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型,从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。?
  3. 应用前景
  经过近几年的发展完善,甲醇酵母表达系统已日趋成熟,应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒,如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等,利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入,它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。

目的基因的获得编辑本段回目录

从事一项基因工程,通常总是要先获得目的基因,倘若基因的序列是已知的,可以用化学方法合成,或者利用聚合酶链式反应(PCR)由模板扩增。此外,最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库或cDNA文库,从中选择出目的基因进行克隆。 

(一)基因文库的构建 

基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。在理想条件下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。通常包含以下五个步骤: 

1.染色体DNA的片段化:利用能识别较短序列的限制性内切酶对染色体基因组进行随机性切割产生众多的DNA片段。 

2.载体DNA的制备:选择适当的λ噬菌体载体,用限制性内切酶切开,得到左右两臂,以便分别与染色体DNA片段的两端连接。 

3.体外连接与包装:将染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接,然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白在体外包装)。

4.重组噬菌体感染大肠杆菌:重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入细胞,重组DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞,产生的溶菌产物组成重组噬菌体克隆库,即基因文库。 

5.基因文库的鉴定、扩增与保存:构建的基因文库应鉴定其库容量,需要时可进行扩增。构建好的基因文库可多次使用。

(二)cDNA文库的建立 

真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物由于外显子与内含子镶嵌排列,转录产生的RNA须切除内含子拼接外显子才能最后表达,因此真核生物的基因是断裂的。真核生物的基因不能直接在原核生物表达,只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA(cDNA),再接上原核生物的表达控制元件,才能在原核生物中表达。还有,mRNA很不稳定,容易被RNA酶分解,因此真核生物须建立cDNA文库来进行克隆和表达研究。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。 

建立cDNA文库与基因文库的最大区别是DNA的来源不同。基因文库是取现成的基因组DNA,cDNA文库是取细胞中全部的mRNA经逆转录酶生成DNA(cDNA),其余步骤二者相类似。构建cDNA文库的基本步骤有5步:①制备mRNA;②合成cDNA;③制备载体DNA(质粒或λ噬菌体);④双链cDNA的克隆(cDNA与载体的重组);⑤cDNA文库的鉴定、扩增与保存。 

(三)基因库中克隆基因的挑选分离 

基因文库和cDNA文库建立起来后,下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆,这是一件难度很大,费时费力的工作。一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体,这种方法叫做“选择”;另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查,这种方法叫做“筛选”。 

1.原位杂交法:这一种利用特异探针的直接选择法,是一种十分灵敏而且快速的方法。

显然,有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。探针的获得有如下方法: 

①如果目的基因序列是已知的,或部分序列是已知的,探针可以从已有的克隆中制备,或用PCR方法扩增。 

②如果目的基因是未知的,而有其他物种的同源序列,那么可以用同源序列做探针。 

③如果目的基因未知,但知道它对应的蛋白质序列,可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。 

2.扣除杂交法:这是一种筛选方法,难度很大,是面对目的基因未知,同源基因未知,蛋白质序列未知的情况的。基本原理是找到该基因的高表达细胞,提取相应的mRNA,并与一般细胞提取的mRNA进行比较,分离一般细胞不存在而高表达细胞存在的mRNA,然后用该mRNA逆转录生成cDNA。 

(四)聚合酶链式反应扩增目的基因 

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是DNA体外酶促扩增,故又称无细胞分子克隆。它模仿体内DNA反复复制的过程,用DNA聚合酶在体外合成DNA。1985年由Mulis K发明。PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段,能在实验室里的一支试管内,将所要研究的一个目的基因或某一DNA片段,在数小时内扩增至百万乃至千百万倍,使得皮克(pg)水平的起始物达到微克(μg)水平的量。只要一根毛发、一个精子、一滴血的DNA样本,或福尔马林固定、或石腊包埋、或冷冻数万年的组织,都可用于基因结构的分析。PCR现已成为生命科学实验室获取某一目标DNA片段的一种常规技术,已广泛地应用于医疗工程、生物工程、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医学和考古学等领域。 

1.基本原理 

PCR方法模拟体内的DNA复制,首先加热使DNA双链变性为单链,然后退火(降温)至变性温度点以下,单链DNA与加入的小片段DNA引物复性,随后适宜温度下在耐热的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)作用下自引物延伸子链。不断重复高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤,使样品DNA大量扩增。 

2.PCR的反应条件 

①模板DNA(需扩增的目的基因或序列); 

②2种不互补的DNA片段引物; 

③4种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP); 

④耐热DNA聚合酶; 

⑤缓冲液。 

3.温控 

反应开始时94℃加热5~10min使DNA完全变性,然后进入循环。每一轮循环包括: 

①加热,94℃,45s,高温促使DNA变性成单链; 

②退火,55℃,1min,使单链DNA与引物粘合; 

③延伸,72℃,1~1.5min,Taq DNA最适温度促使DNA子链自引物延伸。 

最后一次循环时延伸时间延长到10min,促使所有子链充分延伸。最后通过电泳分离进行分析。 

4.应用 

①在分子生物学的一些应用:产生大量已克隆化双链DNA中的特定序列,从少量mRNA生成cDNA文库,选择性扩增特定的cDNA区段,生成大量单链DNA进行序列测定,构建突变体和重组体等。 

②在细菌类疾病诊断中的应用:分枝杆菌、淋球菌DNA检测。 

③对病毒类疾病诊断中的应用:人类巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒的检测。 

④在遗传疾病诊断上的应用 :PCR已有效地应用于诊断单基因疾病及产前诊断和携带者的检测。第一个应用PCR进行产前诊断的疾病为镰刀形红细胞贫血症。目前,国内外许多单位采用此法来诊断多种遗传性疾病。如镰刀形红细胞贫血、地中海贫血、血友病A、血友病B、Duchenne肌萎缩、囊性纤维变性、神经纤维瘤、成年多囊肾、视网膜母细胞瘤等。 

⑤在肿瘤诊断上的应用:与人类肿瘤相关基因研究最多的为ras基因族,ras基因族包括H- ras、K- ras及N- ras三类基因,该族基因的第12、13及61位密码最易发生点突变,以后便获得了转化潜能,产生ras癌基因。具转化潜能的ras基因广泛存在于多种肿瘤细胞系,有时也存在于人的肿瘤组织内。根据这三类基因的DNA顺序,设计引物,将包括点突变部位的DNA进行PCR扩增,再根据正常的顺序及可能发生突变的顺序设计合成并成多种探针,用标记的探针与PCR扩增DNA杂交,即可判断是否有突变。 

⑥在法医物证学上的应用:种属鉴定、性别鉴定、个人识别、亲子鉴定。 

⑦在器官移植上的应用:器官移植是治疗重要器官晚期实质性病变所致功能衰竭的最好办法。目前,常进行移植的重要器官有骨髓、肾、心、胰、肝等。成功的器官移植受者能够接近正常人一样地生活和劳动。器官移植的成功与否,关键的问题之一是宿主对移植器官是否产生排斥反应,以及反应的强度。因此,实现器官移植的一项重要内容就是进行人的组织相容性系统的测定。目前流行的测定HLA的方法主要是血清学方法和细胞学方法。但是,这两种方法均有操作繁琐、材料来源困难、保存要求高、花费时间长等缺点。而且,以上述方法,HLA的某些等位基因仍无法检测。PCR技术的建立和发展,使得对HLA基因进行直接测定成为可能。它能直接作基因分型,具有操作简单、方便、快速、灵敏等特点,而且不会受抗HLA血清和活淋巴细胞等方面的限制,对器官库的建立将提供十分有用的技术手段。 

(五)获得目的基因的其他方法 

  如果基因序列完全已知,可以通过化学方法进行人工合成。通过定位诱变也可以获得突变基因。

外源基因导入宿主细胞 编辑本段回目录

(一)外源基因导入原核细胞 

将外源基因导入宿主细胞以改变遗传性状称为转化(transformation);将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞称为转染(transfection),以与病毒的感染(infection)相区别。 

1.氯化钙导入法:1944年,Avery就已成功地将DNA进入到导入到肺炎双球菌。1970年Mandel和Higa将大肠杆菌细胞置于冰冷的CaCl2溶液中,然后瞬间加热,λDNA随即高效转染大肠杆菌。用氯化钙法使大肠杆菌处于感受态,从而将外源导入细胞,至今仍然是应用最广的方法。其机制可能是低温下钙使质膜变脆,经瞬间加热产生裂隙,外源DNA进入细胞内。 

2.电穿孔法: 采用脉冲高压电瞬间击穿质膜使外源DNA高效导入细胞,现在采用电穿孔仪进行。导入效率与电位差和细胞大小有关系,动植物细胞通常只需数百伏,而小细胞的细菌需要数千伏。最初电穿孔仅用于动植物细胞,现在已经有专门用于细菌、真菌的电穿孔仪出售。 

3.λ噬菌体导入法:以λ噬菌体为克隆载体,可以与大的目的基因重组,只要导入的基因大小不破坏噬菌体外壳蛋白包装就行。这种克隆载体的好处是噬菌体本身具备感染特性,因此导入效率很高。 

(二)外源基因导入真核细胞 

基因工程有时需要将外源基因导入真核细胞,以进行基因改造和表达。常用的真核工程细胞包括酵母细胞、动物细胞和植物细胞。酵母菌由于生长条件简单,成为真核生物基因工程有限选择的宿主细胞。酵母细胞存在细胞壁,因此需先将细胞壁用纤维素酶水解掉,然后在氯化钙和聚乙醇刺激使重组DNA被吸收,再将无细胞壁的酵母细胞置于琼脂平板上培养就能生出细胞壁来。 

外源DNA导入动植物细胞的方法多种多样,主要有以下几类: 

1.磷酸钙共沉淀法:利用Ca2+沉淀外源DNA(DNA上的磷酸基带负电)沉积在细胞质膜上而促进吸收(可能通过细胞吞噬)。 

2.脂质体法:将类脂经超声波、机械搅拌等处理形成双脂层小囊泡,将外源基因包入,然后与细胞共育,类脂囊泡与细胞质膜融合而使DNA导入细胞。 

3.脂质转染法:用人工合成的阳离子类脂与外源DNA结合,借助类脂容易穿越脂膜的特性将DNA导入。 

4.电穿孔法 

5.显微注射法:对于较大的细胞如卵细胞,采用极细的玻璃注射器针头将外源DNA注射入细胞内。 

6.Ti质粒导入法:此法的宿主细胞是裸子植物和双子叶植物。利用根瘤土壤杆菌的一段转移DNA(T-DNA),它能携带基因转入到植物细胞内并与染色体DNA整合。这种方法须先将目的基因插入T-DNA,借助土壤杆菌将外源基因导入细胞。土壤杆菌可以从植株伤口侵入,吸附在植物细胞壁上,T-DNA随即进入植物细胞内,土壤杆菌并不进入植物细胞。 

7.病毒导入:外源基因插入病毒DNA中,利用病毒的感染特性将DNA导入细胞。 

8.基因枪(高速微弹发射装置):用直径1微米左右的惰性重金属粉作为微弹,如钨粉或金粉,其上沾有DNA,置于档板的凹穴内。当用火药或高压气体发射弹头撞击档板时,微弹即以极高的速度射入靶细胞,从而将附着其上的外源DNA导入。 

克隆基因表达 编辑本段回目录

    基因工程通常是为两个目的,一是基因的扩增,二是取得该基因的蛋白质表达。对于第二个目的,在克隆载载体上必须具备控制RNA转录的基因序列,使其在寄主细胞里能表达产生蛋白质。 

    当克隆基因大量扩增表达后,下一步的工作就是分离纯化得到DNA或蛋白质产品。

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