一、普通光学显微镜观察方法 (一)苏木素-伊红染色(HE 染色法) 石蜡组织切片的HE染色 1、取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片。 2、切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗:二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min。 3、苏木素染色5min,自来水冲洗。 4、盐酸乙醇分化30s(提插数下)。 5、自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。 6、置伊红液2min。 7、常规脱水,透明,封片:95%乙醇(I)min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3:1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。 (二)甲基绿-派诺宁染色法 1、新鲜取材组织固定液中4℃固定3~6小时。 2、直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。 3、切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水。 4、置染色液中室温下染片约 1h 。 5、取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液。 6、插入丙酮中迅速分化。 7、转入丙酮二甲苯( 1 : 1 )稍洗。 8、 二甲苯透明 2 ~ 3 次。 9、 中性树胶封固。 (三) Giemsa 染色 1、收集细胞( 1 × 106 ), PBS 洗 1 次。 2、用细胞涂片离心机制成细胞涂片。 3、甲醇固定 3 ~ 5min 。 4、入 Giemsa 稀释染色液 15 ~ 30min ,冬天在 37 ℃温箱中染色。 5、用磷酸盐缓冲液分色,以镜下控制为准。 6、涂片晾干后用中性树胶封片。 (四)瑞氏( Wright )染色 1、收集细胞( 1 × 106 ), PBS 洗 1 次。 2、用细胞涂片离心机制成细胞涂片。 3、甲醇固定 3 ~ 5min 。 4、用 Wright 液染色 2min 。 5、入 Wright 磷酸缓冲液稀释液 4 ~ 10min ,然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深,可 0.08 %醋酸分化数秒钟。 6、直立晾干后,用中性树胶封固。 |
二、透射电子显微镜观察方法 培养细胞的取材和固定 1、常规收集帖壁和悬浮细胞,置离心管中离心, 800 ~ 1000r/min , 10min 。 2、用 0.01mol/L PBS 5ml 重悬细胞。 3、将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。 4、离心, 2000r/min , 15 ~ 20min ,使细胞成团。 5、小心吸去上清,加入 2.5 %戊二醛固定液固定细胞团,以免细胞团散开。 6、取出离心管内的琼脂,仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。 7、将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中, 4 ℃(可长期)保存。 8、用 0.1mol/L PBS 缓冲液洗 1 次。 9、1 %锇酸后固定 30 ~ 60min 。 三、荧光显微镜观察方法 (一)吖啶橙染色法 1、制备活细胞悬液,浓度约为 107 /ml 。 2、取 95 μ l 的细胞悬液,加 5 μ l 的吖啶橙贮存液混匀。 3、吸一滴混合液点洁净玻片上,直接用盖玻片封片。 4、荧光显微镜选用激发滤片 BG 12 或 BV 等,阻断滤片用 515nm 或 SP3 。 (二) Hoechst33258 染色法 1、原代细胞培养,细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。 2、细胞固定液 4 ℃固定 5min 。 3、蒸馏水稍洗后,点加 Hoechst33258 染色液, 10min 。 4、蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体。 5、封片剂封片后荧光显微镜观察。 (三) Hoechst33342 染色法 1、将 Hoechst33342 加入培养的细胞中,终浓度为 10 μ g/ml 37 ℃孵育 30min 。 2、4 %的多聚甲醛和培养液以 1 : 3 混合,使多聚甲醛的浓度为 1 %,固定细胞 5 ~ 10min 。 3、固定好后,将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。 4、荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片,阻断滤片为 400 ~ 500nm 。 以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法,也可先固定后染色: 1、 收集( 0.5 ~ 3.0 )× 106 个细胞, 500 ~ 1000r/min ,离心 5min 去上清。 2、PBS 洗 1 次, 500 ~ 1000r/min ,离心 5min 去 PBS 。 3、用 3 %多聚甲醛 50 μ l 重悬细胞,室温下固定 10min 。 4、PBS 洗 1 次, 500 ~ 1000r/min 离心 5min 去 PBS 。 5、用 15 μ l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞,终浓度为 16 μ g/ml ,孵育 15min 。 6、取 10 μ l 放在玻片上,荧光显微镜下观察,可数 500 个细胞,计算调亡率。 |
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