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磁性微球在生物学中的应用

标签: 磁性微球 生物学 应用

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一、磁性微球在核酸纯化上的应用

核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础,除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外,它与生命的异常情况,如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究,还是进行基因工程、蛋白质工程,首先需要对核酸进行分离纯化。

超顺磁性磁性微球是细胞分离、鉴定,基因分析,细菌和病毒的病原体诊断,核酸分离分析,蛋白质纯化的一个有效手段。通过寡聚核苷酸[Oligo(dT)]序列或链霉亲和素等将DNA和RNA连接磁性微球表面已开发了许多应用。

1、DNA/RNA结合蛋白分离

在基因表达中,蛋白质也是一个重要角色,然而与DNA/RNA特异性结合得蛋白质通常寿命都很短,且含量少,链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离DNP/RNP。结合有生物素的DNA或RNA序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用,蛋白质识别了这些序列,就可在几分钟内结合到固定化DNA/RNA上,这种方法已被用来分离转录因子,限制性内切酶,复制蛋白等。

2、mRNA分离

在研究基因表达中,结合免疫磁性细胞分离和基于磁珠分离后进行逆转录(Reverse transcription)及聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增,是一种强有力的手段。典型哺乳动物一个细胞中只有大约10pg的RNA,而mRNA则仅占总RNA的1-5%。传统的mRNA分离技术含有总RNA纯化,即基于Oligo(dT)-纤维素亲和色谱柱的PolyA+RNA选择,此过程费时并费力。因此,Oligo(dT)25磁性微球被用于从复杂溶菌液中提取mRNA。Poly(A)-tail是mRNA序列上普遍存在的一段碱基,因此磁珠表面只需要有Oligo(dT)25序列,就可以有效地与mRNA上的Poly(A)-tail杂交,这种杂交非常迅速,在1-2分钟内就可完成,能有效地除去rRNA, tRNA以及其他RNA,且有70-100%的回收率。除去溶菌液的洗涤,整个提取只需耗时十五分钟,且只用一个管,也不必前面的纯化步骤。利用Oligo(dT)25磁性微球可在一小时内从单核细胞和T-淋巴细胞,B-淋巴细胞等中提取出mRNA,磁珠也可以经过改性后对血液、骨髓中的癌细胞进行检测或进行单核细胞(mononuclear cell)制备。此外,磁珠还可从动、植物组织中分离Mrna,比如,曾有人从血清、血浆、骨髓液中分理出聚腺苷酸(polyadenylated viral)RNA病毒:HIV-1RNA,从肝、脾、植入石蜡组织,以及果蝇中都提出了mRNA。

利用这些磁珠从动、植物细胞、组织等复杂样品中提取的mRNA,可用于构建cDNA文库。Oligo(dT)25磁珠消除了总RNA纯化,柱色谱处理,过滤,有机溶剂提取,醇沉淀等过程,酶的下游应用也不会因为磁珠的存在而受到抑制。Oligo(dT)25磁性微球最重要的特性还在于可定量提取mRNA,使得定量RT-PCR和环境监测成为可行。实现mRNA提取高通量也已成为可能,Fang和Otto等已报道了96孔板和384孔板磁分离,可同时进行96或384个样品的提取。

二、磁性微球在细胞标记和细胞分离上的应用

细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术,高效的细胞分离在细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术,高效的细胞分离在临床中是首要的、重要的步骤。这种细胞分离技术在医疗临床诊断上有广范的应用,例如治疗癌症需在辐射治疗前将骨髓抽出,且要将癌细胞从骨髓液中分离出来。传统的细胞分离技术主要采用离心法,利用密度梯度原理进行分离,时间长、效果差。随着合成磁性微球的发展,免疫磁性微球在分离细胞方面已经获得了快速的发展,经动物临床试验已获成功。其中最重要的是选择一种生物活性剂或者其他配体活性物质(如抗体、荧光物质、外源凝结素等),根据细胞表面糖链的差异,使其仅对特定细胞有亲和力,从而达到分离、分类以及对其种类、数量分布进行研究的目的。磁性微球用于细胞分离需要考虑以下几个因素;不与非特定细胞结合、具有灵敏的磁响应性、在细胞分离介质中不凝结。Jhunu等人用外源凝结素分别修饰聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球,通过实验发现两者都有分离红细胞的能力,白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的效率高得多,但是成本高。Wedemeyer N等人则将高分子磁性微球结合不同的DNA而可以达到经济快速分离各种不同的细胞的目的。

利用磁流体或超顺磁性物质标记细胞已是体内细胞分离中日趋普遍的方法。多流体或超顺磁性物质标记细胞已是体内细胞分离中日趋普遍的方法。多数当前用的标记技术主要包括以下两种方法:将磁性微球连接到细胞表面;通过液相内吞、受体调解内吞或噬菌作用使生物相容性磁性微球内在化。有效而特异性的磁性微球细胞标记策略就是用能经过受体中介吞噬而被靶细胞吸收的配基,如单克隆抗体,对磁性纳米微球进行改性。靶向配基如:转铁蛋白、乳转铁蛋白、白蛋白、胰岛素、生长因子等已被用于修饰细胞表面,且这些配基稳定性好,并无免疫原性。

而目前发展迅速的细胞磁分离技术,设备简单,费用低廉,仪器操作简便,不影响细胞活性,且可实现连续分离,可克服荧光激活细胞分离法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)和免疫亲和柱分离法中,仪器昂贵,设备复杂,处理量小,且收集的细胞活性低的缺点。

免疫磁性细胞分离法(Immunomagnetic cell separation methods)在细胞生物学中越来越成为专家学者关注的焦点。免疫磁性细胞分离依靠两种机制实现靶细胞分离。直接方法就是通过将亲和配基(即抗体)连接到磁性微球上,形成表面结合单克隆抗体的免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres, IMMS),此抗体能特异性地与靶细胞结合并使之具有磁响应性,当此结合物受到外磁场作用时,可以使靶细胞与其它杂质分离。间接法就是先将自由亲和配基(抗体)加到细胞悬液中,孵化后没有结合配基的细胞被洗掉,而抗体-靶细胞复合物则通过标记有另一配基(即二抗)的免疫磁性微球捕获。

三、磁性微球作为药物载体的应用
      
磁性高分子微球作为药物载体,被注射到动物体内,在外加磁场下,通过纳米粒子的导航,移向病变区,这就是磁性纳米粒子在药物中应用的基本原理。用磁性高分子微球作为药物载体可以提高药效,降低药物对正常细胞的伤害,成为磁控导弹,这也是当今的热门课题之一。Widder、Senyei、Monrimoto等人广泛研究磁性微球,但是制得的粒径多为1~3μm,靶向定位效果不好。日本的Sako等制成海绵铁颗粒(30μm),治疗肝癌、肾癌等.后来人们发现将化疗药物和磁性材料一起包封于载体材料中,进人体内后在外磁场作用下使微球聚集于病变部位,可提高靶区内的药物浓度,从而提高疗效,减少用药剂量,降低全身毒副作用.Morimoto Y等通过动物实验发现,在没有磁场的作用下,药物主要集中在肝脏,而在磁场作用下,静脉注射磁性微球达到外界放有磁场的肺部,动脉注射磁性微球到达部.Guph P K等实验发现磁性微球载有1/3的剂量的药物,在靶区的浓度是自由药物的8倍,而且在非靶向区域(肝、心脏)的药物浓度明显降低.Iannotti J P等人报导在外界磁场的作用下,50%—80%的微球定向到病变区,而无外界磁场时只有20%的微球可到达病变区.磁性高分子微球一般通过下面3种方式结合:

1、药物与高分子先结合成微球,磁粉再吸附其表面;

2、磁粉和高分子先结合成微球再吸附药物;

3、磁粉、药物、高分子一起混合经均匀化后再微球化。Devineni等人合成magnetic microsphers methotrexate (MM-MTX) 药物载体用以治疗肿瘤,MTA通过2—二甲胺甲基—1—乙基链接在磁性粒子的表面,通过水解可以释放药物.但是实验发现在45min内药物又重新分配,导致小鼠的死亡.此类问题有待进一步研究解决。

四、磁性微球在蛋白质和多肽的分离与纯化上的应用

传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性,但采用连在磁珠上的单克隆抗体进行免疫沉淀富集,SDS-PAGE电泳法检测则可达想要结果。用磁珠分离细胞溶菌液中的蛋白质,几乎不需要预先处理,与其他方法相比,非特异性结合也较少。

要从全血,培养上清液,血清,腹水中分离蛋白质,用于制备、分析,运用磁珠作为固相载体进行免疫测定的优点在于快速的结合动力学和简单的分离,洗涤过程。在蛋白质纯化中,为了得到高结合容量需使用大孔如粒径为3.5um,并用链霉亲和素修饰的磁珠,生物素修饰的免疫球蛋白(IgM)可顺利结合到磁珠上。键合配基的活性不会因孔结构而改变。

金属鳌合磁珠亲和纯化是一种纯化重组蛋白的方法。在磁珠表面共价键合Nitrilotriacetic acid (NTA),加入Ni2+ 形成鳌合亲和磁珠纯化组氨酸标记的多肽 。利用低浓度咪唑可将鳌合的肽洗脱。这种磁性鳌合载体为含量稀少,疏水,不稳定的重组蛋白和多肽纯化提供了新的思路。

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