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间接血凝检测应用实例

标签: 间接血凝试验 应用 实例 巴氏杆菌荚膜 水泡病

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一、间接血凝检测多杀性巴氏杆菌荚膜抗原

1、材料与试剂

(1)绵羊红血球;

(2)标准多杀性巴氏杆菌荚膜菌种A、B、D、E;

(3)待测荚膜群的多杀性巴氏杆菌;

(4)戊二醛(G.R.);

(5)pH7.2的PBS液;

(6)阿氏液(Alserers)

葡萄糖 2.05g

柠檬酸钠(5H2O) 0.80g

柠檬酸(H2O) 0.05g

NaCl 0.42g

H2O 加至 100.00ml

混合过滤,8磅15min灭菌备用。

2、操作方法

(1)多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备

在血清裂解血琼脂平板上筛选待测的多杀性巴氏杆菌荧光性典型的菌落(荧光性弱的可通过小白鼠或本动物复壮),接种于血清裂解血琼脂斜面或改良马丁汤琼脂斜面,每株接两管,于37℃培养16h左右,达融合生长后,用2ml生理盐水(每管1ml)洗下,收集于小试管中,于56℃水浴30min,然后以8 000r/min离心30min,取上清液即可。

(2)红血球的醛化

无菌采取绵羊血,以阿氏液保存或以玻璃珠脱纤,用生理盐水将红血球洗涤3次,以pH 7.2 PBS配制成5%的悬液(以全血量为50%红血球计算),另将戊二醛以pH7.2PBS稀释成2.5%的溶液。

5%红血球 100ml

2.5%戊二醛溶液 20ml

混合后以磁力搅拌器室温搅拌1h,用生理盐水洗涤4次,再用pH7.2PBS液配制成50%的醛化红血球悬液(即加至原血量的体积),加1/万硫柳汞防腐,分装小瓶,置4℃保存备用。

(3)红血球致敏 2ml荚膜抗原加入50%醛化红血球悬液0.20ml,充分混匀,37℃作用2h,中间轻轻振荡数次,离心去上清,再用生理盐水洗涤一次,最后加入10ml生理盐水,混匀,即为1%的致敏红血球液。

(4)荚膜高免血清的制备和处理 选Cartor A、B、D、E 标准菌株分别接种于马丁琼脂斜面,37℃培养10h~18h,以灭菌生理盐水洗下,加福尔马林处理,使其达0.3%福尔马林菌液浓度为200亿/ml~300亿/ml的悬液。选一岁左右的健康绵羊作为制备荚膜高免血清用的动物。第一次皮下注射加有氢氧化铝佐剂的死菌抗原2ml,2~3周后开始用不加佐剂的死菌悬液,每周注射2次,剂量为1ml,1ml,2ml,2ml,3ml,3ml,……10ml,最后放血,常规收获血清,即为荚膜定型用高免血清。

取A、B、D、E标准荚膜高免血清 2ml,置56℃灭活30min,加入50%醛化红血球0.4ml,37℃作用2h,离心去红血球即可。各成分加毕后,充分摇匀,置室温中2h~3h观察结果。

3、结果判定

+++: 凝集的红血球铺得较宽,或卷边或有缺口。

++: 凝集的红血球平铺管底,呈沙撒布。分布不均匀,边缘不整齐。

+: 凝集的红血球面积较小,凝集程度轻微。

-: 红血球形成小而光滑的圆点或有空心。

以“++”为样品的滴度终点。

二、反向间接血凝检测猪传染性水泡病病原

1、材料与试剂

(1)高免血清

以猪传染性水泡病乳鼠毒苗免疫成年猪,10天后攻毒,攻毒后蹄部发生水泡。四星期后第二次攻毒,再过二星期,放血收集血清。

(2)免疫球蛋白IgG的提取

以高免血清加等量0.01Mol/l pH 7.0 PBS,逐步滴加饱和硫酸铵液使成20%饱和,静置1h,滤纸过滤,滤液加饱和硫酸铵液使成50%饱和,静置1h,离心、沉淀,加 PBS至原血清容量。以33%饱和硫酸铵沉淀3次,最后沉淀以少量PBS洗下,透析,过Sephadex G50,浓缩、透析,过DEAE-纤维素柱。洗脱液用0.0175Mol/L pH6.4PB液。收集蛋白组成,测定蛋白含量。

(3)双醛固定血球

绵羊红血球,以丙酮醛、甲醛固定。

(4)致敏血球

以1%血球悬液,IgG以130μg/ml~160μg/ml致敏为适宜。

(5)标准抗原

水泡皮磨碎,以生理盐水作1┱5~1┱10的稀释,置室温2h~3h,离心去上清。水泡液以1┱5稀释用。

(6)健康猪蹄冠皮

猪口蹄疫水泡皮及水疱液。处理方法同上。

2、操作方法

在有机玻璃板96孔V型底微量反应板上加稀释液,每孔一滴,每份样品两排孔,一排为测定孔,另一排为对照孔。以微量滴管取样品抗原材料。在测定排孔及对照排孔第一孔,各加一孔,顺序进行倍比稀释,每排最后一孔不加样品,作为空白对照。

在测定孔,加入稀释液一滴,在对照孔,加入高免血清(1┱100稀释)一滴。于微型振荡器上振荡,盖上薄片,置37℃条件下30min~60min.

在反应孔板上,每孔加入1%的致敏红血球悬液一滴,混匀置室温(25℃左右)2h左右,观察结果。

3、结果判定

同上例。

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