一、材料及试剂 1、猪瘟单抗纯化抗原 2、兔抗猪IgG酶标抗体 3、猪瘟阳性血清 4、猪瘟阴性血清 1~4均由指定的生物制品所购买。 5、ELISA反应板 6、包被液 碳酸钠 1.50g 碳酸氢钠 2.93g H2O加至 1 000ml pH值9.6 7、PBS液 氯化钠 8.90g 磷酸二氢钾 0.20g 无水磷酸氢二钠 2.13g 加双馏水 1 000ml 8、PBS-吐温洗涤液 PBS液 1 000ml 犊牛血清 5ml 混合即可 9、底物溶液 ⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液 柠檬酸 21g 双蒸馏水加至 1 000ml ⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O 71.6g 双蒸馏水 加至 1 000ml ⑶ pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 取⑴液 24.30ml ⑵液 25.70ml 混匀即可 ⑷邻苯二胺液 取⑶液 50ml 双馏水 50ml 磷苯二胺 20mg 30%H2O2 0.15ml 待邻苯二胺溶化后再加H2O2,现用现配。 10、终止液 浓H2SO4(98%) 22.2ml H2O 177.80ml 二、操作方法 1、用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释,每孔包被100µl,4℃湿盒过夜。 2、次日取出,甩去孔内液体,3×3′冲洗。 3、将待检血清以PBS液做400倍稀释,每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释,于对照孔中加100μl.37℃温育1.5h~2h。 4、重复第二步,取出,甩去孔内液体,3×3′洗涤。 5、将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释,每孔加100μl,37℃温育1.5h~2h。 6、重复第4步。 7、每孔加底物溶液100µl,室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时,立即终止反应,并以阴性孔做空白对照。 8、每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。 三、结果判定 在猪瘟弱毒酶联板上,OD≥0.2,为猪瘟弱毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟弱毒抗体阴性。 在猪瘟强毒酶联板上,OD≥0.5,为猪瘟强毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟强毒抗体阴性。 |
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