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免疫测定（immunoassay，IA）是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的方法。基于抗原抗体反应的特异性和敏感性，免疫测定的应用范围遍及医学检验的各个领域。任何物质只要能获得相应的特异性抗体，即可用免疫测定进行检测。可测定的对象包括：具有免疫活性的免疫球蛋白、补体、细胞因子等；微生物的抗原和相应的抗体；血液凝固因子；以及临床化学测定中微量而难于分离的物质，如蛋白质、同工酶、激素、药物、毒品等。 由于免疫测定在医学检验中的地位日益重要，近年来新方法、新技术不断出现。从总体上说，其进展主要在自动化和简便化两个方面。 一、 免疫测定自动化[1，2，3] 随着检验医学的发展，检测项目和标本量急剧增加，在大型实验室中自动化系统取代手工操作是必然的趋势。20世纪50年代生化自动分析仪即取得实际应用。免疫测定在技术上有其特殊性，自动化发展较迟，20世纪80年代后才有自动化分析系统问世。目前除放射免疫测定外，几乎所有的免疫测定方法均可进行全自动分析。 按分析过程的不同，免疫测定可分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两大类。标本中的抗原与试剂抗体反应后，形成结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗体；测定两者之一即可计算出标本中抗原的含量。在一般情况下需将结合的（B）和游离的（F）分离后再进行测定，此为异相。在特殊情况下，B和F具有不同的特性，不必分离即可进行测定，此为均相。均相和异相两种免疫测定在自动化系统的设计中具有各自的特点。 1、均相免疫测定 （1） 免疫浊度测定 这是最简单的免疫测定方法。标本中待测抗原与试剂抗体（一般为特异性抗血清，也可用抗体包被的微粒以提高敏感度）混合，反应后形成颗粒性的抗原抗体复合物而导致反应液混浊，而剩余的游离抗体不产生浊度。因此不必进行B和F的分离即可通过浊度测定而计算出标本中抗原的含量。 免疫浊度可以采用临床化学中的透射浊度法（turbidimetry），通过测量透射光的减弱而进行测定。因此只要有合适的试剂，可以在生化分析仪中作全自动分析。另一种方法为散射浊度法（nephelometry），通过测量颗粒的散射光以反映浊度的强弱。散射浊度仪一般与试剂配套供应。全自动分析系统有Beckman-Coulter公司的Array和Immage，以及Dade-Behring公司的Nephelometer 100和BN ProSpec等。Array和Nephelometer 100已被广泛应用。新型的Immage 和BN ProSpec将于2002年在我国推出。免疫浊度测定的敏感度约为50ng/ml，最适用于测定血浆蛋白的含量。 （2） 均相标记免疫测定 用于小分子物质特别是药物浓度的测定。模式为竞争法，即标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，然后进行标记物的测定。在特定的情况下，与抗体结合的标记物失去其特性，因此不需将B与F分离即可直接测定F中标记物的量。 a、 均相酶免疫测定 1972年Syva公司开发的酶扩大免疫测定技术（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）和1992年Microgenics公司开发的克隆酶供体免疫测定（clone enzyme donor immunoassay，CEDIA）均属均相酶免疫测定，酶标记的抗原与抗体结合后，其中的酶就失去其活性。酶活力的测定方法与临床化学法相同，因此应用这两种方法的试剂在生化自动分析仪即可进行标本的检测。也有专用于EMIT和CEDIA的全自动分析仪。 b、 荧光偏振免疫测定 在荧光偏振免疫测定（fluorescence polarisation immunoassay，FPIA）中，荧光素标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，反应后用单一平面偏振的光源照射，荧光素被激发产生偏振荧光。偏振荧光的强度与分子转动的速度成反比。标记抗原与抗体的复合物分子量大，旋转慢，偏振荧光强；游离标记抗原的分子量小，偏振荧光弱。因此不需进行B和F的分离即可进行测量。这一技术在20世纪80年代即被Abbott公司用于药物浓度的测定，其开发的自动分析系统名为TDx。 2、异相免疫测定 大部分标记免疫测定均属异相。最常用的B和F的分离手段为固相载体的洗涤，但在临床化学测定中无此步骤。因此异相免疫测定的自动化不能借助于生化自动分析仪，各种方法均有其特殊的自动分析系统。 （1） 固相酶免疫测定 通用的名称为ELISA，即酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay）。在ELISA中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等类型。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置。 a、微孔板式自动分析仪 不同厂家生产的板式ELISA试剂种类繁多，但均采用规格统一的8×12的96孔微板。因此仪器厂生产的板式ELISA自动分析仪均为"开放式"的，即适用于各家的试剂产品。微孔板每一孔的彻底清洗是ELISA的关键，亦是自动分析的难点。因此直至近年才有全自动的板式分析仪问世。Bio-Rad公司的CODA自动酶免疫分析仪和Dynex公司的DIAS型微孔板自动处理系统均可同时进行多块微板的全自动测定。 b、其他形式固相载体的自动分析仪 微孔板以外的固相载体形式，其自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。 管式载体的特点是小管可同时作反应和比色的容器。Boehringer Mannheim公司开发的ES300型分析仪是管式的配有专用试剂的全自动分析系统，在国内曾被不少单位采用。但自该公司并入Roche公司以后，各型ES仪器已停止生产。 Abbott公司最早采用0.6cm直径的小珠作为载体，小珠放在相应大小的塑料孔盘中滚动冲洗，属半自动类型。Roche公司的COBAS COREⅡ自动分析仪则采用粒径较小的小珠，为全自动的分析系统。 Abbott公司应用胶乳微粒作为载体的MEIA（微粒子酶免疫测定）自动分析系统较小珠型更为先进，胶乳微粒可吸附在玻璃纤维膜上进行洗涤。这种自动分析系统称为IMx，现在与TDx合并组成全能型的Axsym系统。 磁性微粒表面积大，可用磁铁吸引进行分离，是较为理想的载体。瑞士Serono公司的酶免疫分析仪属此类型。这种载体已被其他标记免疫测定所采用。 （2） 时间分辨荧光免疫测定 早在1941年荧光抗体已应用于免疫组化技术。但荧光免疫测定则发展较迟，作为定量分析必须克服荧光本底高和荧光猝灭的难点。1983年Soini和Kojola用新型的荧光物质作为标记物，建立了时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay）。其基本原理是镧系元素铕螯合物被激发后产生的荧光寿命比一般的荧光长，因此可待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量。以此原理开发的自动分析仪称为DELFIA（dissociation-enhanced lanthanide fluorescence immunoassay），现在由芬兰Wallac公司生产。固相载体亦为微孔板。与板式ELISA分析仪的主要不同点为采用特殊的时间分辨荧光计进行测量。 （3） 化学发光免疫测定 化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是近年来发展的标记免疫测定。化学发光底物在化学反应后发出的光子可通过发光光度计（luminometer）进行测量。化学发光免疫测定分三种类型，均有自动分析仪器供应。 a、化学发光酶免疫测定 这是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。Amersham公司早期开发了以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性的化学发光酶免疫测定系统AMERLITE，经Johnson & Johnson 公司改良后商品名为VITROS Eci。Beckman Coulter公司生产的ACCESS应用的标记酶为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒。特殊的试剂组合保证了测试的稳定性和重复性。类似的分析系统有Diagnostic Production Corporation 公司的IMMULITE。 b、化学发光免疫测定 这是以化学发光底物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。Chiron公司生产的ACS180是以吖啶酯为标记物、以磁性微粒为载体的自动分析系统，可作为这一类型的代表。该仪器现由Bayer公司生产，新的型号ADVIA CENTAUR将于2002年在我国推出。应用一种性能优良的吖啶酯衍生物，Abbott公司开发了新型化学发光免疫测定系统ARCHITECT，亦将于2002年在我国上市。 c、电化学发光免疫测定[4] 电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）的原理为：发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。 Boehringer Mannheim 公司利用电化学发光原理开发的免疫测定系统称为ELECSYS，1997年投入大量生产。在该系统中并采用链霉亲和素包被的磁性微粒，配以生物素结合的抗原或抗体，使反应几乎在液相中进行，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。ELECSYS有1010和2010两种型号，现由Roche公司生产。新产品为模块式的E170仪器，将于2002年在我国推出。 二、免疫测定简便化 免疫测定另一方面的进展为简便化。简便化的特点是：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定。近几年发展的固相膜免疫测定[5]完全符合以上要求，成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）[6]中广为应用的方法。 固相膜免疫测定的特点是以硝酸纤维素膜为载体和有色微粒作为标记物。最常用的标记物为红色的胶体金，因此一般称为金免疫测定。在这种测定中，B和F的分离有渗滤和层析两种形式。 1、金免疫渗滤试验 免疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）始创于1985年，最初以酶作为标记物。1989年Du Pont公司推出了用于检测抗HIV抗体的金免疫渗滤试验（GIFA），确立了GIFA的基本技术。 GIFA是只需试剂，不需仪器的检测方法。试剂盒有两个主要组份：一个为金标记的抗体，另一为渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，盒盖中央小孔下放置硝酸纤维素膜一片，膜上包被抗体或抗原。试验时将标本滴加膜上，通过渗滤抗原抗体在膜上反应；然后滴加金标抗体，渗滤反应如上。阳性结果在膜上出现红色斑点。全过程在数分钟内完成。 90年代初期GIFA展开了多方面的研究和开发，用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。国内1991年即有GIFA试剂生产，用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂取得了广泛应用。 2、金免疫层析试验[6] 1990年Oskiowicz等建立了免疫层析试验（immunochromatography assay,ICA），其原理与IFA相同；不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流（flow through），而是基于层析作用的横流（lateral flow）。Oskiowicz应用的标记物为胶体硒，其后一般均采用简便的胶体金，称为金免疫层析试验（GICA）。 GICA试剂为试纸条形式。在一塑料片条上依次粘贴如下组份：（1）吸水纸；（2）玻璃纤维膜，膜上固定着干燥的金标抗体；（3）硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状的抗体；（4）吸水纸。以上各组份首尾互相衔接，因此在（1）处滴加液体标本，液流即向（4）处移动。当液体到达（2）处时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应而形成复合物。液流继续前移至（3），金标记的复合物再与膜上的抗体结合而呈现红色的线条，多余的金标抗体继续前移至（4）处。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。 GICA试剂结构简单，小型实验室即有条件开发生产。近年来发展生产GICA试剂的单位如雨后春笋，目前试剂的品种已多达数十种，测定项目包括HCG、LH等激素，肿瘤标志物，传染病的抗原和抗体，心血管病标志物等，并有继续发展的趋势。 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制[7]。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求[7]。另一种类似的定量测定心肌标志的免疫层析测定系统，应用荧光物质作为标记物，由美国Biosite公司生产，商品名TRIAGE Cardiac Panel[6]。 三、结束语 随着免疫学技术和自动化技术的发展，免疫学测定取得了突飞猛进的发展。值得注意的是，不论自动化还是简便化，直接的研究和开发几乎全部由生产单位所推动。回顾国内，国产自动分析仪尚属空白；国内免疫测定试剂的生产正在向高质量和稳定性方面努力，创新产品凤毛麟角。可喜的是进入新世纪以来，在简便化的领域中国内已研发出与国际同步的检测系统，如AFP和HCG的金标定量测定系统和测定肿瘤标志的蛋白芯片系统均即将问世。相信在不久的将来在免疫测定的领域中我们一定能跻身于国际先进行列。 参考文献 1、陶义训主编.免疫学和免疫学检验.第2版.北京:人民卫生出版社,1997,140-180 |
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