[器材和试剂] ● PCR试剂和设备 ● 含有起始scFV基因的载体pHENl单链模板DNA(50ng/ul) ● Geneclean试剂盒 ● Wlzard PCR纯化试剂盒 ● scFvJHL2XhoFOR引物:5'-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC-3' ● scFvJH3XhoFOR引物: 5,-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC3' ● scFvJH4-5XhoF()R引物:5,-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC-3' ● scFvJH6XhoFOR引物: 5'-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3' ● XhoI限制性酶(NEB) 以及厂家的2号缓冲液(NEB2) ● VL基囚文库载体 [方法] 1. 配制50ul PCR反应混合液, 包含: ● 水,34.5ul ● 20XdNTP(每种5mmol/L), 2,5ul ● 10XVent聚合酶缓冲液,5.0ul ● LMB3引物(10pmol/u1),2.5ul ● scF讨HXhoFOR引物(10pmol/ul),2.5ul ● scFv模板DNA(100ng), 2.0u1 ● VentDNA聚合酶(2单位),1.0u1 2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应混合液到94℃,5分钟。 3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次,扩增VH基因。 4. 用Wizard PCR纯化试剂盒芝之PCR产物。 5. 用XhoI和NcoI消化PCR产物;但除了用XhoI替代 NcoI,还需在NEB2缓冲液中进行消化。 6. 制备VL基因文库载体;但需用XhoI和NcoI消化载体。 7. 连接已消化的PCR产物和已消化的载体,并电转化到大肠杆菌TG1中,构建轻链改组文库。 |
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