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单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化

标签: 单克隆抗体 亲和层析柱 纯化

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重组人α干扰素作为一种具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长及免疫调节作用的细胞因子新型药物,已在国内外广泛投入临床应用,并取得了显著的疗效。国际上对用于临床的重组干扰素的纯度要求很高,美国NIH规定必须在90%以上,因此生产者普遍采用亲和层析纯化法。我们研制了rHuIFN-α2a的McAb 3F1,与CNBr活化的Sepharose 4B交联制成亲和层析柱,经1年60余次较大规模试用表明具有较理想的亲和层析纯化rHuIFN-α2a的性能,达到了国内外同类McAb的水平。由于McAb 3F1也能和rHuIFN-α2b结合,故极有可能亦适用于rHuIFN-α2b的亲和层析纯化。

一、性能指标

1.McAb的特性:IgG1,间接ELISA效价10-7,对rHuIFN-α2a具中和活性。

2.洗脱的rHuIFN-α2a纯度:>90%。

3.洗脱的rHuIFN-α2a比活性:≥1×109IU/mg。

4.rHuIFN-α2a的回收率:≥95%。

5.亲和柱的稳定性:4℃操作和保存情况下,使用60余次1年时间性能无明显下降。

6.与国外McAb比较:各项指标绝不亚于英国Celltech公司生产的McAb NK2。

二、操作方法

1.rHuIFN-α2a的粗提:表达rHuIFN-α2a的工程菌用盐酸胍裂解,过DEAE凝胶柱粗提,收集活性峰。

2.亲和层析:rHuIFN-α2a粗提物用pH7.2,0.15mol/L PBS透析过夜,上样于经pH7.2,0.15mol/L PBS平衡的亲和层析柱,流速0.5ml/分,然后用大量PBS流洗至流出液OD280≤0.02,再用pH2.4,0.1mol/L甘氨酸-HC1洗脱,洗脱液立即转至pH7.2,0.15mol/LPBS中透析过夜,测定蛋白浓度、纯度和活性。

三、保存方法

1.亲和柱的再生:先后用10个柱床体积、含0.5mol/L NaCl的pH8.5,0.1mol/L Tris-HCl和pH4.5,0.1mol/L醋酸钠缓冲液流洗亲和柱,再用pH7.2,0.15mol/L PBS充分平衡。

2.贮存:加入1/万的叠氮钠防腐,贮存于4℃冰箱。

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