一、材料和试剂 1、玻片:须用免疫组化专用玻片,或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。 2、5-10%正常山羊血清封闭液,用PBS配。 3、3%牛血清白蛋白(BSA),用PBS配。 4、0.01M pH7.4 PBS 5、1% BSA-PBS(含0.05% Tween20) 6、AEC底物 (1)底物缓冲液(20X) PH 4.6 醋酸(分子量60.6) 30.6ml Triton X-100 醋酸钠 3H2O(分子量136.1)66.68克 加蒸馏水到960ml,调pH到4.6,最后加蒸馏水到总体积1000ml。 (2)AEC(20X) AEC 15mg/ml,溶在DMF(二甲基甲酰胺,分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中) (3)0.6% H2O2(20X) 临用时,(1)(2)(3)各50ul,在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。 7、DAB(即DAB-4HCL) (1)1.5克DAB在100ml水溶液中(20X) (2)1M Tris(20X),用HCl调PH到7.4 (1)(2)(3)各滴加入1ml二蒸水中,新鲜配,避光,30分钟内有效。溶解后(可加热到50℃),加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral Hyclrate,分子量165.4),枸橼酸1克,充分溶解,于棕色瓶中,室温或400C保存。 8、苏木素复染液 苏木素 1克 碘酸钠 0.2克 钾矾 50克 水 1000ml 9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。 10、3% H2O2:30% H2O21份,加9份双蒸水,临用时配。 11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板 12、封片液:1克明胶,溶于30ml 35℃水中,加入35ml甘油(或用甘油封片)和650mg石碳酸(先溶于0.6ml水中)。 二、细胞内源过氧化物酶阻断(使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断) 1、从冰箱取出细胞片或细胞板,置室温或37℃ 10-15分钟,使恢复温度。 2、加3% H2O2,细胞片20ul/孔,培养板100ul/孔,使充分覆盖住细胞。 3、室温10分钟后,甩掉 H2O2,用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份,96孔在滤水纸上扣干,但注意保持细胞湿润。 三、封闭 细胞片用5-10%正常山羊血清(20ml/孔),细胞板用2-5%BSA(PBS配制)100ul/孔,置37℃孵育30分钟后甩掉封闭液,不洗。 四、免疫化学染色 1、分别加一抗和所有对照一抗,细胞法10-20ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜; 2、弃去一抗,如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后,浸于100 mL含PBST洗杯,漂洗(最好在慢速摇床上)3-5分钟,转入第二杯PBS(100 ml),如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分,96孔板则倒掉一抗后,每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉,在滤纸上扣干,但保持细胞湿润,反复3-4次; 3、加SP试剂(SP法,即放大法) (1)加已优选好的浓度的Biotin标记二抗,细胞片10ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分复盖细胞。37℃孵育30分钟; (2)按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干; (3)加已优选好浓度的SP试剂,用量同“(1)”,37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干; 4、间接法加二抗(不放大法) 方法同SP法,但不用Biotin标记二抗,而改用HRP直接标记二抗。并省略(3)步骤; 5、加底物显色 (1)加足量的AEC显色液,充分覆盖细胞层,细胞玻片20ul/孔,细胞培养板50ul/孔,置于37℃恒温箱孵育5-10分钟,一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间,以得到满意的结果(阳性对照显色程度为“+++” ),用自来水即可终止反应; (2)复染:苏木素染液(使用时间最好不超过两个月)加苏木素复染液1-2滴,1分钟左右,在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素,再浸于PBS中约30秒钟返蓝,最后在蒸馏水中漂洗。 6、封片 洗后细胞片擦去周围水分,滴加1滴甘油—明胶封片液,加盖玻片,除去气泡,用指甲油或树胶封固玻片。 五、结果判断 阳性——诱导细胞有10%-30%显红色,强度不一,未诱导阳性细胞(1-30%);阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色(排除边缘效应) 六、注意事项 1、一抗、二抗的稀释采用1% BSA/PBS,Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS; 2、整个反应过程在湿盒中进行(细胞片); 3、洗涤时应使用染色缸(细胞片); 4、对照系统,必须要做的对照系统:阳性对照:标准一抗,阳性血清,阳性上清;阴性对照:(1)阴性一抗对照:小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液;(2)阴性抗原细胞对照:未感染病毒的细胞,每个待测及对照均须做阴性细胞对照:空白对照:不加一抗,用1%BSA替代;无关对照:与本项目无的第一抗体。 |
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