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酶免疫细胞化学染色操作指南

标签: 免疫细胞化学 染色 操作指南

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一、材料和试剂

1、玻片:须用免疫组化专用玻片,或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封闭液,用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白(BSA),用PBS配。

4、0.01M  pH7.4  PBS

5、1% BSA-PBS(含0.05% Tween20)

6、AEC底物

(1)底物缓冲液(20X) PH 4.6

醋酸(分子量60.6)  30.6ml

Triton X-100

醋酸钠 3H2O(分子量136.1)66.68克

加蒸馏水到960ml,调pH到4.6,最后加蒸馏水到总体积1000ml。

(2)AEC(20X)

AEC  15mg/ml,溶在DMF(二甲基甲酰胺,分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中)

(3)0.6% H2O2(20X)

临用时,(1)(2)(3)各50ul,在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。

7、DAB(即DAB-4HCL)

(1)1.5克DAB在100ml水溶液中(20X)

(2)1M Tris(20X),用HCl调PH到7.4

(1)(2)(3)各滴加入1ml二蒸水中,新鲜配,避光,30分钟内有效。溶解后(可加热到50℃),加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral Hyclrate,分子量165.4),枸橼酸1克,充分溶解,于棕色瓶中,室温或400C保存。

8、苏木素复染液

苏木素  1克

碘酸钠  0.2克

钾矾  50克

水    1000ml

9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。

10、3% H2O2:30% H2O21份,加9份双蒸水,临用时配。

11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板

12、封片液:1克明胶,溶于30ml 35℃水中,加入35ml甘油(或用甘油封片)和650mg石碳酸(先溶于0.6ml水中)。

二、细胞内源过氧化物酶阻断(使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断)

1、从冰箱取出细胞片或细胞板,置室温或37℃ 10-15分钟,使恢复温度。

2、加3% H2O2,细胞片20ul/孔,培养板100ul/孔,使充分覆盖住细胞。

3、室温10分钟后,甩掉 H2O2,用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份,96孔在滤水纸上扣干,但注意保持细胞湿润。

三、封闭

细胞片用5-10%正常山羊血清(20ml/孔),细胞板用2-5%BSA(PBS配制)100ul/孔,置37℃孵育30分钟后甩掉封闭液,不洗。

四、免疫化学染色

1、分别加一抗和所有对照一抗,细胞法10-20ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜;

2、弃去一抗,如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后,浸于100 mL含PBST洗杯,漂洗(最好在慢速摇床上)3-5分钟,转入第二杯PBS(100 ml),如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分,96孔板则倒掉一抗后,每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉,在滤纸上扣干,但保持细胞湿润,反复3-4次;

3、加SP试剂(SP法,即放大法)

(1)加已优选好的浓度的Biotin标记二抗,细胞片10ul/孔,细胞板50ul/孔,使充分复盖细胞。37℃孵育30分钟;

(2)按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干;

(3)加已优选好浓度的SP试剂,用量同“(1)”,37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干;

4、间接法加二抗(不放大法)

方法同SP法,但不用Biotin标记二抗,而改用HRP直接标记二抗。并省略(3)步骤;

5、加底物显色

(1)加足量的AEC显色液,充分覆盖细胞层,细胞玻片20ul/孔,细胞培养板50ul/孔,置于37℃恒温箱孵育5-10分钟,一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间,以得到满意的结果(阳性对照显色程度为“+++” ),用自来水即可终止反应;

(2)复染:苏木素染液(使用时间最好不超过两个月)加苏木素复染液1-2滴,1分钟左右,在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素,再浸于PBS中约30秒钟返蓝,最后在蒸馏水中漂洗。

6、封片

洗后细胞片擦去周围水分,滴加1滴甘油—明胶封片液,加盖玻片,除去气泡,用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判断

阳性——诱导细胞有10%-30%显红色,强度不一,未诱导阳性细胞(1-30%);阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色(排除边缘效应)

六、注意事项

1、一抗、二抗的稀释采用1% BSA/PBS,Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS;

2、整个反应过程在湿盒中进行(细胞片);

3、洗涤时应使用染色缸(细胞片);

4、对照系统,必须要做的对照系统:阳性对照:标准一抗,阳性血清,阳性上清;阴性对照:(1)阴性一抗对照:小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液;(2)阴性抗原细胞对照:未感染病毒的细胞,每个待测及对照均须做阴性细胞对照:空白对照:不加一抗,用1%BSA替代;无关对照:与本项目无的第一抗体。

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