二、缓冲液

免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常不同。在此介绍几种最常用缓冲液的配制。

1、0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer，PB）

试剂： NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O。

配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。

（1）0.2mol/L的NaH₂PO₄；称取NaH₂PO₄·2H₂O 31.2 g 或NaH₂PO₄·H₂O 27.6g加重蒸水至1000ml溶解。

（2）0.2mol/L的Na₂HPO₄：称取Na₂HPO₄·12H₂O 71.632g（或Na₂HPO₄·7H₂O 53.6g或Na₂HPO₄·2H₂O 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O，充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。

2、0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）

试剂：0.2 mol/L PB　　　    50ml

　　   NaCl 　　　　　　　8.5～9g（约0.15mol/L）

　   　重蒸水 　　　　　　至1000ml

配制方法：称取NaCl8.5～9g及0.2mol/L的PB50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。

PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/L PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。

3、Karasson–Schwlt's磷酸盐缓冲液

试剂：  NaH₂PO₄·H₂O            3.31g

　　     Na₂HPO₄·7H₂O           33.77g

     　　重蒸水 　　　　　　　至1000ml

配制方法：同前。该缓冲液主要用于配制Zamboni's固定液。

4、0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。

试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)　　60.57g

　   　1 N HCl　　　　　　　　　约420ml

　   　重蒸水 　　　　　　　　　至1000ml

配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris，加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。

该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。

5、Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered Saline，TBS）

试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液　　　100ml

　   　NaCl　　　　　　　　　　　3.5～9g（0.15mol/L）

　　  重蒸水　　　　　　　　　　　至1000ml

配制：先以重蒸水少许溶解NaCl，再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。

TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。

6、Tris-TBS（TBS）

试剂：Triton X-100　　　　　　         　10ml（1%）或3ml（0.3%）

　  　 0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）　　1000ml（50ml）或（0.2mol/L的PB）

　    　NaCl　　　　　　　　　　　　　8.5～9g

　　    重蒸水　　　　　　　　　　　　至1000ml

配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。

该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。

7、0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液

试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠　　　　　　500ml

　    　0.1N HCl　　　　　　　　　　　28ml

　　   蒸馏水　　　　　　　　　　　　至1000ml

配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g，加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl1.7ml加蒸馏水至1000ml，配成0.1N，最后取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1N HCl28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。

三、显色液

免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：

1、DAB（Diaminobenzidine）显色液

DAB即3，3-二氨基苯联胺

试剂：DAB（常用四盐酸盐）　    50 mg

　  　 0.05mol/L TB 　　　　　　100 ml

　　    30% H₂O₂　　　　　　　30～40 μl

配制方法：先以少量0.05mol/L（pH7.6）的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%，过滤后显色前加入30%的H₂O 230～40μl，使其终浓度为0.01%。

DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO₄处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24 h后使用。

2、4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液

配方1：4-Cl-1-萘酚 　　　　　　　  　100 mg

　     　纯乙醇　　　　　　　　　　　 10 ml

　    　0.05 mol/L TB(pH7.6)　　　　　190 ml

　　    30% H₂O₂　　　　　　　　　　10 μl （0.003%）

配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入TB19ml，用前加入30%H₂O₂使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。

配方2：4-Cl-1-萘酚、N-二甲基甲酰胺（DMF）、0.05mol/L TB（pH7.6）、30% H₂O₂。

配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H₂O₂，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50 ℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。

4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。

3、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）显色液

试剂：AEC　　　　　　　　　　            　20 mg

　　   二甲基甲酰胺（DMF）　　　　　　2.5 ml

　   　0.05 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　 　50 ml

　　   30%H₂O₂  　　　　　　　　　　 　25 ml

配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H₂O₂。切片显色时间为5～20min。

该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

4、TMB显色液

试剂：TMB、HCl、亚硝基铁氰化钾、无水酒精。

配制方法：

（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。

（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。

（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。

（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5 ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H₂O₂。

（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H₂O₂（每100ml孵育液中加0.3%的H₂O₂1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4 h、直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5 min后贴片、脱水、封片。

TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2 h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

5、NBT显色液

试剂：A液  5%NBT：称取0.5g NBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温； B液  5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10 ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。

显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl（pH9.5，0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl₂）管内，充分混匀；再加入B液40 μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。

NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium），MW=818，为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。