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沉淀反应实验二:琼脂扩散实验(图)

标签: 沉淀反应 实验 琼脂 扩散

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二、琼脂扩散实验

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。

抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时,便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时,便依各自扩散速度的差异,在适当部位形成独立的沉淀线,因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。

(一)单向琼脂扩散实验

1、材料

(1)诊断血清(抗体:抗人IgG或IgA免疫血清)

(2)待检血清(抗原):人血清

(3)参考血清:全国统一人血清免疫球蛋白参考血清(批号不同,免疫球蛋白含量不同)。

(4)其它:生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。

2、方法

(1)将适当稀释(事先滴定)的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。

(2)在免疫琼脂板上按一定距离(1.2—1.5厘米)打孔,见图1。

(3)向孔内滴加1:2,1:4,1:8,1:16,1:32稀释的参考血清及1:10稀释的待检血清,每孔10微升,此时加入的抗原液面应与琼脂板一平,不得外溢。

(4)已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。

(5)测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线,再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。

(二)双向琼脂扩散实验

1、材料

(1)诊断血清:兔抗人血清

(2)待测血清:人血清

(3)阴性对照血清

(4)其它:生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。

2、方法

(1)取一清洁载玻片,倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。

(2)凝固后,用直径3毫米打孔器,孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。

(3)用微量进样器于中央孔加抗体,于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。

(4)加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

(5)结果观察:若凝胶中抗原抗体是特异性的,则形成抗原—抗体复合物,在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线,为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为真正阳性。

(6)结果分析:琼脂扩散结果受许多因素影响。

①、抗原特异性与沉淀线形状的关系:在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时,则可出现两单沉淀线的融合。反之,如相邻抗原完全不同时,则出现沉淀线之交叉;两种抗原部分相同时,则出现沉淀线的部分融合。见图3。

②、抗原浓度与沉淀先导形状的关系:两相邻抗原浓度相同,形成对称相融合的沉淀线;如果两抗原浓度不同,则沉淀线不对称,移向低浓度的一边。见图4。

图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系

a、b:抗体 A、A’、B:抗原A、B完全不同 A、A’部分相同

③、温度对沉淀线的影响:在一定范围内,温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时,为了减少沉淀线变形并保持其清晰度,可在37℃下形成沉淀线,然后置于室温或冰箱(4℃)中为佳。

④、琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响:一般来说,琼脂浓度越大,沉淀线出现越慢。

⑤、参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响:抗原、抗体相距越远,沉淀线形成的越慢,所以在微量玻片法时,孔间距离以0.25-0.5cm为好,距离远影响反应速度。当然孔距过远,沉淀线的密度过大,容易发生融合,有碍对沉淀线数目的确定。

⑥、时间对沉淀线的影响:沉淀线形成一般在1-3天出现,14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现,一般观察72小时,放量过久可出现沉淀线重合消失。

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