二、琼脂扩散实验

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。

抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。

（一）单向琼脂扩散实验

1、材料

（1）诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）

（2）待检血清（抗原）：人血清

（3）参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。

（4）其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。

2、方法

（1）将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。

（2）在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。

（3）向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。

（4）已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。

（5）测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。

（二）双向琼脂扩散实验

1、材料

（1）诊断血清：兔抗人血清

（2）待测血清：人血清

（3）阴性对照血清

（4）其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。

2、方法

（1）取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。

（2）凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。

（3）用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

（4）加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

（5）结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。

（6）结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。

①、抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。

②、抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。

图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系

a、b：抗体 A、A’、B：抗原A、B完全不同 A、A’部分相同

③、温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。

④、琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。

⑤、参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。

⑥、时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。