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免疫荧光组织(细胞)化学技术系列六:荧光显微镜检查方法

标签: 免疫荧光化学 组织 细胞 荧光显微镜

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1、荧光显微镜

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具,分透谢和落射二种类型,落射光无需镜内操作,方便、效果更好。它是由超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

2、荧光显微镜标本制作要求

(1)载玻片

载玻片厚度应在0.8-1.2mm之间,太厚的玻片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光亮清洁,厚度均匀,无明显自发荧光,有时需用石英玻璃载玻片。

(2)盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光又可激发标本。

(3)标本

组织切片或其它标本不能太厚,若太厚,激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发。另外,细胞重叠或杂质掩盖,背景非特异染色引起的荧光影响结果判断。

(4)封裱剂

封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/L pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影。配方是将P-次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS10m1中,调pH至9.0~9.5,再加入甘油90ml,混匀,在室温放置过夜,待其中小气泡完全消失即可使用。

(5)镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,可用甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。对于落射光荧光显微镜BX60,Nikon E-1000无须镜油。

3、使用荧光显微镜注意事项

(1)严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。

(2)应在暗室中进行检查。进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。

(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。

(4)检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱或褪色;所以最多不得超过2~3h。

(5)荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

(6)标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发。

(7)荧光亮度的判断标准:一般为四级,即“—”——无或可见微弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。

4、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度。在判断结果时,必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标,即凭工作者目力观察,作为一般定性观察,基本上是可靠的。随着技术科学的发展,采用细胞分光光度计、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要,由于荧光很易减弱褪色,要及时摄影记录结果。方法与普通显微镜摄影技术基本相近。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上。因紫外光对荧光萃灭作用大,如FITC的标记物,在紫外光下照射30s,荧光亮度就有降低。有的荧光强度不够,曝光速度太慢,只能用人工掌握曝光时间,将荧光图像拍摄下来。研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微数码相机摄影系统装置,如Nikon公司2001年在我国推出了Nikon E-1000全自动荧光显微镜配备有Cool CCD与计算机联接,将图像采集在软盘上,再与彩色打印机连接,直接打印照片。

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