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ELISPOT技术简介及原理(CTL)

标签: ELISPOT ELISA 技术简介 原理

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一、ELISPOT 技术简介

随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体,但由于游离的循环抗体或 CK 的半哀期不同,使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合,而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。80 年代,国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用,对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自ELISA ,又突破传统ELISA 法,是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们最大的不同在于:

1、ELISA 通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

2、ELISPOT 也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过 CTL 公司的 ELISPOT 分析系统对斑点进行计数,1 个斑点代表 1 个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)。

3、由于是单细胞水平检测,ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏,能从 20 万 -30 万细胞中检出 1 个分泌该蛋白的细胞。

4、捕获抗体为 BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。

二、ELISPOT 检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后,被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后,PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

三、ELISPOT 分析仪的出现解决了以下问题

1、哪些斑点是抗原特异性T 细胞产生的(此斑点具有进一步分析价值),哪些是无关细胞产生的(此斑点没有T 细胞研究价值)?

2、斑点大小的意义?

3、在对不同细胞因子计数和分析时,如何定义斑点最大和最小尺寸?

4、如何从单个细胞基础上分析?

5、实验精确度有多高?如果一个细胞产生相似的细胞因子,在多大程度上会干扰分析结果?6、几次重复实验才能使结果更有意义?

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