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用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

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1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)之后,Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极大的兴趣。人们推测其可能成为这类疾病的致病因素之一。许多研究者正进一步探索其致病机理,并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止,检测Hp的方法包括组织标本培养,切片染色,细菌直接涂片染色,快速尿素酶测定及13C尿素呼吸试验和14C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成,鉴于取材困难,进一步寻找检测Hp感染的免疫学方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床病人血清中有Hp抗体报道,国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一种检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果,研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应,现将结果报告如下。 

一、材料和方法 

1、材料

①40孔聚苯乙烯微量凹孔板:上海塑料三厂产品。②酶联板离心篮:根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。③DG—Ⅰ型酶联免疫检测仪:南京华东电子管厂产品。④试剂:过氧化物酶(HRP),R2=3.2,美国Sigma公司产品。邻苯二胺(OPD):上海白鹤化工厂产品,按文献配制。包被液:取碳酸钠1.59g加碳酸氢钠2.93g,蒸馏水1000ml配成。洗涤液:以上未加吐温—20的洗涤液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液:5%小牛血清。戊二醛固定液:25%戊二醛液,100ml装,Kochligh进口分装,用时稀释成0.25%戊二醛固定液。终止液:2NH2SO4.⑤抗原的制备:将澳大利亚皇家佩思医院的Hp标准菌株(NCTC11638)及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板,37℃培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定(自制兔抗Hp抗体),然后取单个菌落移种于另一血平板,继续培养3d,经鉴定后将其大量增殖培养,3d后将菌苔刮下,置生理盐水中制成菌液,加福尔马林固定(0.1%~0.3%),4℃过夜,3000r/nin离心30min,沉淀3次,将最后1次沉淀悬于少量PBS液内,用比浊管没出细菌浓度,制成含菌3×109ml,置冰箱冰冻,反复冻融3次,经显微镜检查无菌体存在后,制成可溶性抗原,采用Lowry氏法蛋白定量,-20℃保存备用。⑥临床血清标本:采自胃镜检查患者,随机采取1988年8~10月胃镜检查病人共38人,抽静脉血2ml,分离血清贮存-20℃备用。⑦阴性对照血清,进行ELISA测定,取其平均OD值作对照。⑧酶标羊抗人IgG结合物(SAHIgG—HRP)的制备:按过碘酸盐改良法,略加改进标记制成酶标抗体。即HRP8.0ml,22℃较搅20min.加乙二醇6滴,继续搅拌5min,对pH4.2,0.001mol/L醋酸盐缓冲液(用2molHC1调pH)透析过夜,中间换水4次,加羊抗人IgG(上海生物制品研究所产品)14mg,逐滴加pH,1.0mol碳酸盐缓冲液,使pH升到9.0~9.5,室温较搅2h,加硼氢化钠(4mg/ml)0.2ml,置4℃2h,对pH7.2,0.01molPB-0.4molNaCl缓冲液在4℃透析平衡。换水4次,收取透析袋内结合物,以50%饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后,测定精制结合物,E/P克分子比值合格后,将结合物小瓶分装置-20℃保存,备用。⑨尿素酶测定法和Hp的分离培养法参考文献进行。

2、方法 

并稍加改进,即:抗原包被微量滴定板:用包被液将抗原按2×108亿/ml(含蛋白8.6μg)稀释后,每孔加100μ,离心篮离心20min2000r/min后,倒去孔内液体,然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔,4℃固定30min,倒去戊二醛,用洗涤液洗3次(每次3min),加5%小牛血清液,200ml/孔,经37℃30min封板后倒去孔内液体。每孔加待检血清(1:100稀释)100ml,37℃保温1h后,如上洗涤3次,同时做阴性对照孔和空白孔。之后于各孔内加和新鲜稀释的酶标羊抗人IgG结合物100ml,37℃保温半小时,于各孔中加入2NH2SO450μl终止反应后,于酶联测定仪以波长490nm测定OD值,将测得标本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N),若P/N比大于或等于2.0为阳性。

二、 结果

1、ELISA的建立

为了知道所制备的SAHIgG-HRP在是接ELISA中的活性(结合第一抗体,效价),将此酶标抗体稀释成1:16000,1:32000,1:64000,1:128000,1:256000,1:512000六种浓度,将作第一抗体的已知病人Hp感染阳性血清稀释成1:100包被微板的Hp抗原浓度为2×108mg/ml,按上述步骤和主法进行ELISA试验。结果表明,所标记的羊抗人IgG酶标抗体当稀释度为1:32000~1:512000时,它们的P/N值均为≥2.0,因此,了保证实验结果稳定采用个单位效价,即用1:256,000稀释度作正式实验(注1:512000为一个效价单位)。

为了解Hp抗原在包被微量滴定板中最适浓度,将Hp抗原用抗原包被液分别按蛋白浓度稀释成0.27,0.54,1.08,2.15,4.3,8.6,17.2及34.4μg/ml8种浓度,然后分别进行包被,与第一抗体阳性血清(1:100)和SAHIgG—HRP(1:256000)按上述步骤和方法进行ELISA试验。结果,当Hp抗原浓度为8.6~17.2%μg/ml时OD值最高,Hp抗原在34.4μg/ml时,OD值下降,因此Hp抗原包被量最适浓度为。8.6~17.2μg/ml.以后实验用此抗原浓度包板。

为了确定用ELISA测定病人抗Hp抗体的阳性血清浓度,用Hp抗原8.6μg包板,SAHIgG—HRP仍用二个单位(1:256000),将二份阳性血清混后后稀释成1:50,1:100,1:200,1:400和1:800五种浓度进行ELISA试验,测定OD值的结果。结果显示阳性血清稀释度与OD值呈较好的线性关系,当血清稀释度为1:50时OD值为1.521,1:100时OD值是1.172,P/N比值均大于2.0,故以后实验中第一抗体的血清浓度均用1:100的稀释度。

为了验证ELISA间接法用于检测Hp抗体的特异性,进行特异性吸收试验。选用8份Hp感染性血清以1:50稀释,加等量Hp菌悬液,混匀置37℃半小时,再置4℃过夜吸收后离心取上清液按上述实验条件和方法进行ELISA测定,结果见表1。

表1 特异吸收抑制试验结果

吸收处理 8份阳性血清的OD值
  1 2 3 4 5 6 7 8
未吸收 1.588 1.230 1.220 1.555 1.420 1.384 1.354 1.266
吸收后 1.366 0.980 0.917 1.048 1.039 1.039 0.999 0.677
抑制结果

从表1结果可知,阳生血清经吸收1次后,OD值均较吸收前下降,特别8号血清前后相比下降了50%,由此均显示特异吸收抑制试验阳性,证明该8份阳性血清的抗Hp抗体是特异的。为了探索所建立的ELISA间接法检测抗Hp抗体的敏感度,选择6份抗p阳性血清按上述实验条及方法进行ELISA检测,同时与试管凝集试验和显微凝集试验进行比较,结果见表2。

表2 ELISA测定Hp抗体敏感比较结果

吸收处理 6份抗Hp阳性血清测出的最终抗体滴度
  1 2 3 4 5 6 7
ELISA >800 >800 >800 >800 >800 >800 >800
试管凝集 160 320 320 640 320 320 320
显微凝集 320 320 320 320 320 320 320

数字为稀释倍数的倒数

从表2结果表明,6份抗Hp抗体阳性血清用所建立的ELISA间接法测出的抗体效价均>1:800,试管凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1:160~1:640,显微凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1:160~1:320,显然ELISA法比后两者方法敏感的多。

批内误差 将4份阳性血清标本在同一块板上按上述方法重复进行9次ELISA试验,计算各份标本检测OD值结果的变异系数(表3)。

表3 4份阳性血清重复9次ELISA检测(x)

阳性血清号 1 2 3 4
x 0.510 0.394 0.416 0.207
SD 0.028 0.032 0.030 0.014
SV(%) 5.6 8.1 7.19 6.57

从表3得知,批内误差范围是5.5%~8.1%,平均6.87%,显示按上述实验条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA的稳定性好,重复性佳。

批间误差 将5份阳生血清,按上述方法及实条件在1W内反复进行3次ELISA,计算各份标本检测OD值结果的变异系数(表4)。结果指出三批阳性标本的变异系数在0.74%~8.12%之间,平均4.67%,由此亦显示按上述实条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA重复性和稳定性均良好。

2、临床标本检测结果 

将胃镜检查患者的血清以1:100稀释,用上述实验条件建立的ELISA间接法进行,Hp抗体(ELISA-HpAb)检测,同时将同一患者胃粘膜进行Hp分离培养(HpC)和Hp尿素酶测定(HpUT),以资比较(表5)。

表4 5份阳性血清标本进行ELISA的批间误差试验结果

标本号 分批检测阳性血清的OD值 X SD SV(%)
  1 2 3
1 1.266 1.121 1.207 1.198 0.073 6.09
2 1.108 1.021 1.101 1.112 0.049 4.36
3 1.209 1.028 1.125 1.121 0.091 8.12
4 1.060 1.142 1.135 1.112 0.045 4.04
5 1.112 1.096 1.107 1.105 0.008 0.74

表5 ELISA法培养法和尿素酶法对比

方法 n 检测结果
  阳性数 阴性数 阳性率(%)
ELISA-HpAb 38 34 4 89.4
Hp培养法 38 23 15 60.5
HpUT法 38 22 16 57.9

表5结果指出,ELISA-HpAb法的阳性数为34/38(89.4%),Hp培养法的阳性数23/38(60.5%),HpUT法的阳性数为22/3(57.9%),表明ELISA-HpAb法敏感性较另二法都高(ELISA与CP培养法比较X2=8.94,P<0.01。

ELISA-HpAb与HpUT比较X2=9.77,P<0.01。)38例患者用ELISA-HpAb法与培养法(HpC)和HpUT法结果符合率比较,结果见表6及表7。

表6 ELISA-HpAb法与HpC法符合率比较

ELISA-HpAb Hp培养法 合计
 
22 12 34
1 3 4
合计 23 15 38

表7 ELISA-HpAb法与HpUT法符合率比较

ELISA-HpAb HpUT 合计
 
22 12 34
0 4 4
合计 22 16 38

表6及表7比较结果表明,ELISA-HpAb与HpC法的总符合率为65.80,与HCPUT法总符合率为68.4%。在ELISA-HpAb法的34例阳性中HpC法和HpUT法的23例及22例阳性中,ELISA-HpAb法只有一例未检出,由此均表明,ELISA-HpAb法比HpUT法敏感。

三、讨论

关于诊断Hp病的血清学方法,至目前为止主要有补体结合试验,被动血凝集试验,细菌凝集试验等法。但由于这些方法操作繁锁,或敏感性低,或可靠性欠佳,故现已较少采用。自ELISA法建立以来,证明具有敏感性高,稳定性强等优点,国外报道已有人用此法来检测人血清中抗Hp抗体,也证实特异、敏感。但国内尚未有报道证实此法能否用于Hp抗体的检测和诊断Hp感染。本文报道所建立的检测Hp抗体的间接ELISA法实验和初步用于临床标本检测结果证实具有较好的特异性,敏感性(比试管凝集和显微凝集试验敏感<2~3倍)和重复性。为快速诊断Hp提供较好的方法(表1~7)。然而其中操作步骤除按文献报道的一般流程(Hp抗原包被微板→甲醛固定→封闭(牛血清白蛋白)→人Hp抗体温育→羊抗人IgG酶标抗体温育→底物显色→酶联测定仪测定)外,作了若干改进:①Hp抗原的制备:根据文献报告,抗原的制备有超声粉碎,福尔马林固定处理等方法。但Goodwin等认为经过盐酸—甘氨酸制成的可溶性抗原应用于ELISA更加可靠。本文采用抗原是经过福尔马林杀死和固定,用PBS洗三次,置冰箱反复冻融3次后制成的Hp抗原,用蛋白浓度为8.6μg/ml包被微板亦可获得满意结果。②通过2000r/min,20min离心沉淀,戊二醛合固定30min的抗原代替过夜包被同样得到满意结果。③检测血清标本阳性的稀释度(阳性滴度或阳性单位):Goodwin等的报告,用ELISA检测病人血清抗Hp抗体的滴度认为在>1:300(或>300EU)与Hp的胃疾患非常接近。本文通过选择10岁以下儿童血清作正常对照和已知Hp阳性血清进行ELISA试验,根据P/N≥2的判定阳性标准原则结果表明以1:100以上(或>100EU)作为阳性血清标本6份滴度较高的与试管凝集和显微凝集试验对比测定,结果表明,在后二者方法中,均有1:320的抗Hp抗体(表2)。由此也证明用儿童血清作正常对照用用此判断阳性标准是可靠的;同时证实这些病人血清中确实有较高抗Hp抗体。但是,此等判定阳性标准是否非常合适还待进一步实践证实。

ELISA-HpAb法与HpC法和HpUT法的结果比较,前者比后二者的阳性数高(89.4%),符合率分别是65.8%和68.4%(表5)。但常规培养法需时3d~7d,HpUT法较快速,但受活检粘膜内菌量多少及取材部位影响较大,短暂停留在胃内的肠道菌易造成假阳性结果。因此特异性不如ELISA-HpAb法。但是,ELISA-HpAb法与HpC和HpUT法检出的阳性病例数与胃镜检查的诊断和病理诊断是否完全相符,有待进一步的研究和分析。

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