一、脱蜡和水化 方法同SP法。 二、第一抗体的染色 1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10min,PBS冲洗3min×3次; 2、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10min,倒掉(不能冲洗); 3、加入一抗(按照说明书推荐浓度和孵育条件); 4、使用含有0.05%吐温20的PBS(TPBS),冲洗5min×3次; 5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10min; 6、用TPBS冲洗5min×3次; 7、加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗,室温孵育10min; 8、用TPBS冲洗5min×3次; 9、准备底物溶液:将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中,充分混匀。再加入1滴试剂4C,充分混匀; 10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液,室温孵育(镜下掌握孵育时间); 11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。 三、第二抗体的染色 12、加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7),孵育; 13、用TPBS冲洗3min×3次; 14、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10min,倒掉(不能冲洗); 15、加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件); 16、用TPBS冲洗5min×3次; 17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10min; 18、用TPBS冲洗5 min×3次; 19、加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗,室温孵育10min; 20、用TPBS冲洗5min×3次; 21、 准备底物溶液:将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中,充分混匀。再加入1滴试剂6C,充分混匀; 22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液,室温孵育(镜下掌握孵育时间); 23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应; 24、 使用复染试剂染色(根据需要选择); 25、 封片剂(试剂8)封片,显微镜观察并拍照。 |
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