已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。

2. 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。

3. 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。

4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

5. 将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。（TMB空白显色孔除外）。37℃反应60分钟。

6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。

7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30分钟。

8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。

9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。

10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。

11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical density）记录。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）

有两种设定空白对照的方案：

（1）将TMB空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。

（2）将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。

12. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。