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单克隆抗体的非特异性结合阻断

标签: 单克隆抗体 非特异性结合阻断

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一、反应体系

1、 抗体

第一抗体,常用的或自备的抗体

(1)如果第一抗体或自备的抗体能够进行荧光标记(如FITC,PE或其他),请参考直接染色步骤

(2)如果第一抗体不能进行荧光标记,则参考间接染色步骤

2、 第二抗体

经荧光标记过的多克隆抗体

3、 缓冲体系

PBS(Ca2 and Mg2 free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鲜小牛血清(或者0.2%BSA)+0.1%叠氮钠

4、 HAB(e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA)

其他途径购买的经热失活的HAB或经56℃失活1小时的HAB。将其分装成小包装并于-20℃贮藏。

二、步骤

1、 将要检测的样品按常规的方法制成单细胞悬浮液。在最后的步骤中,用1ml预冷的缓冲液至少洗一次,再用预冷的缓冲液将细胞悬浮至浓度为1×107cells/ml(从而50μl=5×105cells)

检测细胞活力是否达到90%。如果细胞活力低于90%,必须通过Ficoll-Hypaque分离法去除死细胞,否则死细胞会非特异地结合到抗体上的。更适宜的方法是将死细胞通过流式细胞仪分析加以区分,以去除死细胞(具体请参考在通过流式细胞仪捕获前在最后的重新悬浮细胞时加入propidium iodide或7-氨基-放线菌素D的方法)

2、 加入50μl的细胞悬浮液至离心管底部。

3、 在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上。

4、 然后加入适宜数量的单克隆抗体至离心管底部,置于冰上。

注意:进行两种或三种颜色染色时,请同时将所有的已经荧光标记的抗体同时加入。

5、 轻轻振荡后,于4℃下暗置30分钟。

6、 用1ml的缓冲液洗两次,然后置于4℃下以备通过流式细胞仪进行捕获。

间接染色法

1-6、如前所述,用经稀释的未标记的单克隆抗体对细胞样品处理;

7、 将细胞沉淀重新悬浮于50μl的HAB中,混匀,于室温中静置1分钟以上;

8、 加入50μl经荧光标记的第二抗体稀释液;

9、 轻轻振荡后于4℃下暗置20分钟;

10、 用1ml的缓冲液洗两次,于250g下离心5分钟;

11、 将样品重新悬浮于1ml缓冲液中,于4℃下避光保存待用。

注意:此法并不适用于Ig表面染色或用抗体直接对FC受体进行染色。

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