一、反应体系 1、 抗体 第一抗体,常用的或自备的抗体 (1)如果第一抗体或自备的抗体能够进行荧光标记(如FITC,PE或其他),请参考直接染色步骤 (2)如果第一抗体不能进行荧光标记,则参考间接染色步骤 2、 第二抗体 经荧光标记过的多克隆抗体 3、 缓冲体系 PBS(Ca2 and Mg2 free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鲜小牛血清(或者0.2%BSA)+0.1%叠氮钠 4、 HAB(e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA) 其他途径购买的经热失活的HAB或经56℃失活1小时的HAB。将其分装成小包装并于-20℃贮藏。 二、步骤 1、 将要检测的样品按常规的方法制成单细胞悬浮液。在最后的步骤中,用1ml预冷的缓冲液至少洗一次,再用预冷的缓冲液将细胞悬浮至浓度为1×107cells/ml(从而50μl=5×105cells) 检测细胞活力是否达到90%。如果细胞活力低于90%,必须通过Ficoll-Hypaque分离法去除死细胞,否则死细胞会非特异地结合到抗体上的。更适宜的方法是将死细胞通过流式细胞仪分析加以区分,以去除死细胞(具体请参考在通过流式细胞仪捕获前在最后的重新悬浮细胞时加入propidium iodide或7-氨基-放线菌素D的方法) 2、 加入50μl的细胞悬浮液至离心管底部。 3、 在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上。 4、 然后加入适宜数量的单克隆抗体至离心管底部,置于冰上。 注意:进行两种或三种颜色染色时,请同时将所有的已经荧光标记的抗体同时加入。 5、 轻轻振荡后,于4℃下暗置30分钟。 6、 用1ml的缓冲液洗两次,然后置于4℃下以备通过流式细胞仪进行捕获。 间接染色法 1-6、如前所述,用经稀释的未标记的单克隆抗体对细胞样品处理; 7、 将细胞沉淀重新悬浮于50μl的HAB中,混匀,于室温中静置1分钟以上; 8、 加入50μl经荧光标记的第二抗体稀释液; 9、 轻轻振荡后于4℃下暗置20分钟; 10、 用1ml的缓冲液洗两次,于250g下离心5分钟; 11、 将样品重新悬浮于1ml缓冲液中,于4℃下避光保存待用。 注意:此法并不适用于Ig表面染色或用抗体直接对FC受体进行染色。 |
→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条
词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0