四、粘附剂 在免疫细胞化学工作中,由于标本(如切片)的脱落常影响工作的质量的速度,故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。 1、铬矾明胶液 试剂:铬矾 0.5 g 明胶(Gelatine) 5 g H2O ~1000 ml 方法:在1000 ml的烧杯或烧瓶中,以500~800 ml H2O加温溶解明胶,待其完全溶解后,再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊,包被玻片时最好控制水温在70 ℃。如有明显残渣,过滤后使用。 2、甲醛-明胶液 试剂:40%甲醛 2.5 ml 明胶 0.5 g 蒸馏水 至100 ml 配制方法:用少许蒸馏水(约80 ml)加热溶解明胶,待完全溶化后,加入甲醛,最后补充蒸馏水至100 ml混匀即可。 3、多聚赖氨酸(Poly-L-Lycine,PLL) 试剂:多聚赖氧酸 5 g 蒸馏水 ~1000 ml 配制方法:称取PLL,溶于H2O,充分混合即可,此液浓度为0.5%,可适当稀释配成0.01~0.5%浓度。4 ℃保存,也可-20 ℃备用。PLL可反复冰冻,效果无明显影响,工作液常再稀释10~50倍。 4、Vectabond试剂 该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同,它是通过对玻璃表面起化学修饰作用,改变其表面的化学物理特性,使组织切片牢固地贴于玻璃片上,贴上后不易脱落,保留时间较久。一个试剂盒(7 ml)可配成350 ml工作液(用丙酮配)。处理载玻片前(事先酸处理),用染色缸装好各种液体,按下列程序进行: 干净载玻片→丙酮5 min→Vectabond试剂工作液(7 ml Vectabond+ 350 ml丙酮):将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1~2次→dH2O,2×5 min→干燥(37 ℃过夜)→用铝箔包好,室温存放备用。 注意:避免污染(尘埃等);综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。 五、封固剂 1、甘油-TBS及甘油-PBS 配制方法:按比例将甘油和TBS(或PBS)充分混合后,置4 ℃,冰箱静止;待气泡排除后方可使用。 2、甘油-明胶(冻) 试剂:明胶 10 g 甘油 12 ml 蒸馏水 100 ml 香草酚 少许 配制方法:称取1 g明胶于温热(约40 ℃)的蒸馏水中,充分溶解后过滤,再加入12 ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。 3、液体石蜡 液体石蜡因含杂质少,很少引起非特异性荧光,故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。 4、DPX 试剂:Distrene 10 g 酸二丁 5 ml 二甲苯 35 ml DPX为中性封固剂,用于多种染色方法匀不易褪色,但组织收缩较明显,故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售,可直接应用。若感过于粘稠,也可加少量二甲苯稀释后应用。注意:二甲苯不可加得太多,二甲苯挥发后,片子上出现许多干燥的空泡,影响观察,遇有这种情况,可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。 |
六、酶消化液 1、0.1%胰蛋白酶 试剂:胰蛋白酶 0.1g 0.1%氯化钙(pH7.8) 100ml 配制方法:先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8,然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃(载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度)。该消化液时间约为5~30min。 2、0.4%胃蛋白酶 试剂:胃蛋白酶 400mg 0.1N HCl 100ml 配制方法:同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。 3、0.06% Pronase 试剂:Pronase 0.06g 0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml 配制方法:同前。 在免疫细胞化学染色中,有时经Formalin过度固定的标本,常会产生过量的醛基,遮盖抗原,影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化,可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异,总之,在保持组织形态不被破坏的前提下,宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中,以第一种最为常用。 七、其它 1、蔗糖溶液 免疫细胞化学中应用的蔗精,常用浓度为5%~30%。一般光镜研究,仅用20%蔗糖处理已足矣,若制备电镜标本,在冰冻前最好经上行蔗糖(5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等)处理,以确保其良好的细微结构。 (1)20%蔗糖液: 试剂:蔗糖 20g 0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml 配制方法:先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖,再加0.1mol/L PB至100ml充分混合,置4℃冰箱保存。 该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液,常浮在上面,当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。 (2)20%蔗糖-5%甘油: 试剂:蔗糖 20g 甘油 5ml 0.1mol/L PB 至100ml(约95ml) 配制方法:先用少许PB溶解蔗糖后,再加入甘油,充分混匀,最后补足PB至100ml,于4℃保存备用。该液主要用于电镜标本的处理,常浸泡过夜(其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右)。蔗糖是一种廉价的防冻剂,兼有脱水的作用,它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小,应用较广。 |
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