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【求助】免疫细胞化学方法请教

标签: 免疫细胞化学

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参与者:sunnyBIO

免疫细胞化学以前没有做过,最近准备做。在网上查找了多种实验方法,但是不知道其中那种方法适合我的实验,希望做过的各位可以给我指点一下。

参与者:zhangyuelin1999

本实验室的免疫细胞化学方法,仅供参考:

1、细胞爬片;

2、PBS洗3次×5min;

3、4%多聚甲醛固定30min(4度冰箱中);

4、3%H2O2 封闭内源性过氧化物酶,室温下10min;

5、PBS洗3次×5min;

6、10%动物血清封闭,室温下10min;

7、甩去血清(不洗),一抗4℃ 过夜;

8、PBS洗3次×5min;

9、二抗室温下1h (或37℃*30min);

10、PBS洗3次×5min;

11、SABC复合物室温下30min~1h (或37℃*30min);

12、PBS洗3次×5min;

13、DAB显色,镜下观察,自来水终止;

14、苏木素复染;

15、梯度酒精脱水:70%酒精、80%酒精、90%酒精各5min ,95%酒精5min×2,100%酒精5min×2;

16、二甲苯透明20min,中性树胶封固。

参与者:淡泊宁静

1、试剂:

(1)0.01M PBS(NaCl 8g+Na2HP04 1.15g+KH2P04  0.2g———1L(pH7.2);

(2)稀盐酸酒精溶液:75%酒精配制1%盐酸;

(3)淡氨水溶液:400ml自来水中滴2滴浓氨水;

(4)伊红溶液:0.5g水溶性伊红染料,溶于l00ml双蒸水中;

(5)苏木素染液:苏木素粉0.5g+铵矾24g加双蒸水70ml+NaI 031g+HgO 5g+甘油30ml+冰醋酸2ml,过滤备用;

(6)4%多聚甲醛。

2、操作步骤:

(1)载玻片上接种细胞10E5;

(2)70%Confluency收集细胞,PBS洗2次*3min;

(3)4%多聚甲醛固定30min;

(4)PBS洗2次*3min;

(5)室温下,0.3%H202封闭15min,以阻断内源性过氧化物酶;

(6)PBS洗3次*5min,干燥;

(7)滴加血清50μl/片,湿盒内37度孵育;

(8)去血清,加一抗,湿盒内37℃孵育45min,4度湿盒内保存过夜;

(9)PBS洗3次*5min,干燥;

(10)加生物素标记的第二抗体50μl/片,湿盒内37℃孵育30min;

(11)PBS洗3次*5min,干燥;

(12)加入链亲和素—过氧化物酶溶液50μl/片,37℃孵育30—60min;

(13)PBS洗3次*5min,干燥;

(14)滴加新鲜配制的0.03%H202/0.05%DAB溶液50μl/片,镜下观察显色10-20min;

(15)自来水冲洗终止反应;

(16)苏木素染液染色2min;

(17)自来水洗,迅速过盐酸酒精溶液,自来水洗;

(18)过氨水溶液返蓝,自来水冲洗。

(19)脱水:70%酒精1次、95%酒精2次、无水乙醇3次,每次lmin;

(20)透明:二甲苯溶液3次,每次lmin;

(21)将有细胞的一面向下,用中性树胶封片。

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