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标签: 免疫荧光化学 组织 细胞 荧光抗体 质量控制

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1、染色特异性和敏感性的测定方法

(1)特异性染色和效价测定

直接染色法中效价以倍比稀释如1:2、1:4、1:8……,与相应抗原标本作一系列染色,荧光强度在“+++”的最大稀释度,为其染色滴度(效价)或单位。实际染色时,可取低一个或两个稀释度(即2~4个单位),如染色效价为1:64,实际应用时可取1:32或1:16。间接染色法中效价可按抗核抗体荧光染色法步骤,先用不同稀释度的荧光抗体染色,结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准,染色用效价和直接法相同。

(2)非特异性染色测定

根据荧光抗体的用途不同,可用类似的抗原切片或涂片,倍比稀释荧光抗体,按常规染色,结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异性染色,否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。

(3)吸收试验

在荧光抗体中加入过量相应抗原,于室温中搅拌2h后,移入4℃冰箱过夜,3000r/min,离心30min,收集上清液,再用于相应抗原阳性标本染色,结果应不出现明显阳性荧光。

2、F/P比值的测定方法

F(荧光素)和P(抗体蛋白)的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量,一般要求F/P的克分子比值为1~2。过高时,非特异性染色增强;过低时,荧光很弱,敏感性降低。

(1)蛋白质定量  测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。

(2)结合荧光素定量  先制作荧光素定量标准曲线,即准确称取FITC 1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中,再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀释到100ml,此时荧光素含量为10μg/ml。以此为原液,再倍比稀释9个不同浓度的溶液,用分光光度计在490nm波长测定光密度值(OD),以光密度为纵坐标,荧光素含量为横座标,作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后,其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm,RB200和蛋白质结合后变为595nm。

F/P比值的计算:

F/P克分子比值=(FITC  g/ml)/(蛋白质mg/ml)×(160000×103)/(390×106)=0.41×(FITC  g/ml)/(蛋白质mg/ml)

式中160000为抗体蛋白质的分子量,390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103,而荧光素从克换算为微克需要再乘以106

测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下:

RB200荧光抗体的克分子比值=[(RB200 g/ml×10-3)/580]/[(蛋白质mg/ml)/160000(IgG)]

TMRITC荧光抗体克分子量比值=A515nmOD/A280nmOD 或=重量比(g/g)×(160000/580)             

 3、荧光抗体的保存

以0~4℃或-20℃低温保存,防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1:5000的硫柳汞或者1:10000,叠氮化钠防腐,小量分装如0.1~1ml,真空干燥后更易长期保存。

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