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免疫组化常见问题及其解决办法

标签: 免疫组化 常见问题 解决办法

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1、 一抗从4度拿出后,为什么要进行37度复温?

(1)一方面,防止切片从4度直接放入PBS易脱片;

(2)另一方面,使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

(3)其实,我更赞同后一种说法,因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。

2、切片染色后背景太深,如何区分特异性与非特异性着色?

全片着色是指整个切片全都染上了颜色,着色的强度可深可浅,总之,分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有:

(1)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。

(2)抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整。

(3)DAB变质和显色时间太长:DAB最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时间过长。

(4)组织变干:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。

(5)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时):原因上不清楚,但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此,不可存放时间太长。

(6)一抗变质、质量差的多克隆抗体:注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

3、脱片产生的原因有哪些?

(1)多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的,迈新按说也是不错的,可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子,要好一点。

(2)组织切的不好,切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀,或者切片者手法不好等。

(3)没烤好,时间短,温度不够之类。

(4)操作的时候甩的太猛了,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩,用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

(5)修复的问题:抗原修复的时候高压时间过长了,或者放进100度的修复液时手法不好,咚的一声就丢进去了,这样超容易脱片。此外,用EDTA修复比柠檬酸容易脱片,但是你要用到EDTA的时候也没办法,只有从另外的问题上着手。

(6)一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎,用PBS的时候尽量用泡的,不要冲。基本上把这些方面都注意到了,能改善的尽量改善,脱片可以减少很多。

(7)组织的问题,我用的组织癌症的很多,越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

4、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么?(尤其是微波修复)

关于抗原修复,我试过的修复条件有EDTA热修复,柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看,微波修复其实很不容易掉片子的,而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起,而微波修复水加热到沸腾,沾在片子上的气泡就会少,不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时,你可以将片子靠的尽量近些,或是在载玻片四周垫些棉花什么的,然后盖上盖玻片,这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为:2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水,调PH值至6.0,微波修复10分钟。你可以试试,时间可以根据需要自己调整。对于柠檬酸修复来说,只要高压修复时间控制在加阀冒气后90秒,冷水下终止开高压锅盖,高压修复和微波修复一样不掉片子,而且一般高压修复效果往往更好一点;关于EDTA热修复,一般说明书上都讲的是PH值等于9,实际上我试过,如果单传用EDTA,很容易掉片子,但是用Tris-EDTA,一般就不会掉片子了,Tris-base的浓度为0.05mmol/L,高压和微波修复都可以,PH也等于9。

5、DAB显色后发现切片着色不均匀:如一片着色,一片不着色或染色浅?

着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系,可能原因有:

(1)切出的片子厚度本身可能就不一样,切出一片厚,一片薄,这样可能造成着色深浅不一。

(2)有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀,造成局部底物浓度不一致,所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下,使片子上所有区域的底物浓度一致。

(3)如果你的片子是中间的染色深,靠近边上的浅,那有可能是你蜡圈画的太小,显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

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