转印到纸上的蛋白质抗原，可与其专一性抗体结合，再以二次抗体-酶结合体（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群转印色带中，专一性地挑出目标蛋白质，是最有用的检定工具 （Burnett,1981）。

药品试剂：

抗体溶液：可用传统抗血清或单株抗体，其最适使用浓度，随抗体效价不同而异，以下为一般适用范围的参考，均以明胶-NET 稀释的。

a. 传统抗血清： 1:100 到1:1,000

b. IgG （冷冻干燥品）： 10~50 μg/mL

c. 单株抗体 （小白鼠腹水） : 1:200到1:5,000

d. 单株抗体 （细胞培养液）： 原液或1:10明胶-NET:用来稀释抗体溶液或酶联体明胶gelatin （Merck 4070, 0.25%） 5.0 gm;NaCl （0.15 M） 17.5 gm;EDTA （5 mM） 3.6 gm;Tween-20 （0.05%） 1.0 mL;Tris （Tris base, 50 mM） 12.1 gm加热溶解于1,800 mL 纯水后pH 调到8.0,再加水到 2,000 mL

酶联体：

可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP,使用浓度每家商品不同，约为1:1,000到1:5,000 的间，以明胶-NET 稀释的。

PBST 洗液

DAB 基质溶液：DAB （diaminobenzidine, Sigma D-5637） 5 mg溶于100 mL Buffer A-0,再加10 μL H2O2,新鲜配制，避光贮存。 DAB 为致癌物质，称量时勿吸入DAB 细尘，并小心处理秤量纸。

方法步骤：

1） 尿素洗过夜的转印纸再以10 mL PBST 洗三次，每次约10 min,均在上述方形培养皿中进行。

2） 转印纸放在明胶NET 溶液中反应，置室温中反应1 h.一般使用方形培养皿当容器，但亦可装入塑料袋中反应，较节省试剂用量。

3） 反应后，以PBST 浸洗二次。

4） 把转印纸放在抗体溶液中反应，置室温反应1 h.

5） 反应后以PBST 洗三次，改用酶联体反应，在室温下反应1 h.

6） 以PBST 洗四至五次，注意容器也要洗干净。

7） 加入DAB 基质溶液约10 mL 呈色，尽量避光，并且不时摇动呈色液。

8） 数分钟内可呈色，在背景加深前倒去DAB,以水冲过数次后晾干。