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应用单克隆抗体技术抗肿瘤的导向治疗是恶性肿瘤的生物治疗方法之一。本文先介绍了单克隆抗体的特点和构型及研究现状,而后从非结合型单抗、单克隆抗体偶联物(包括化学免疫偶联物、放射免疫偶联物、免疫毒素、抗体导向酶-前体药物疗法)和其它(抗体-细胞因子融合蛋白、微型双特异性抗体)等几方面分别介绍了抗肿瘤导向治疗研究进展,并对未来提出了展望和指出了今后的研究方向。

 自从1975年Kohler和Milstein发明了杂交瘤单克隆抗体(单抗)技术以来,单克隆抗体成为导向治疗最常用的载体,以单克隆抗体为载体的导向治疗的报道很多。特别是旨在高特异地杀伤癌细胞的肿瘤的导向治疗研究取得了极大的进展,临床及临床前期试验显示:针对肿瘤抗原设计的单抗具有较好的治疗效果,有望成为继化疗、放疗、骨髓移植等治疗手段后的又一新的治疗方法。本文就单克隆抗体技术导向治疗肿瘤的各种方法作简要介绍:

一、单抗的特点、构型及研究现状

理想的单抗应能特异性结合肿瘤抗原且与正常细胞的交叉反应低,设计时应使其对于不同的肿瘤细胞具有构型、相对分子质量大小的适配性以及杀伤力,可根据需要引入具有特定效应的功能结构域,以确保能将毒性负载特异性地导向肿瘤细胞,同时其抗原性宜低,不引起人体产生相应抗体,以免被快速清除,影响疗效。

基因工程提供了一些方法可以改善单抗的特性

1、通过产生“嵌合型”或“人源化”单抗从而减少“人抗鼠”反应

2、增强效应器官功能

3、改变血浆药物动力学和整个机体清除率

4、增强进入肿瘤组织的能力

5、增强亲和力

6、开发更多的可以有效释放的药物、毒素和生物反应改变剂。为最大限度降低单抗的抗原性,人们设计了“嵌合型”或称“人源化”单抗,即将小鼠型抗体中与抗原结合的部分与人类抗体的支架结合,形成可与相应抗原结合,又不引起免疫排斥反应的“嵌合型”单抗。

目前基因工程抗体研究较多的是小分子抗体,尤其是单链抗体(single chain v fragment scFv)。scFv是将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过肽链相连而获得的重组蛋白,scFv具有分子量小,约相当于完整抗体的1/6;组织穿透能力强,易于进入靶部位,适合靶向治疗;基因结构简单,构建表达方便;免疫源性比相应鼠源单抗小;可以制备融合蛋白;无Fc段,减少非特异性吸附;亲和力高等优点。

90年代以来出现了噬菌体抗体库技术,使人们从利用DNA重组技术改造原有抗体,发展到了用基因工程技术克隆新的抗体,噬菌体抗体库筛选能力强,可获得高亲合力、高稳定性、低免疫原性抗体[6]。

二、非结合型单抗

治疗肿瘤用非结合型单抗依靠单抗诱导的免疫效应或单抗的直接效应杀死肿瘤细胞。单独用单抗的主要优点它们的毒副作用小、相关产物安全。

其抗肿瘤作用主要通过

1、与相应抗原结合引起ADCC效应或CDC,使肿瘤细胞死亡

2、促发细胞内信号系统的改变,促进细胞凋亡

3、抑制肿瘤细胞增殖,促进其分化。非结合型单抗CD2 0 (Rituximab)是治疗淋巴瘤的一种特异性单抗,该药在美国已于1 997年秋被FDA批准,是第一个抗肿瘤单抗,主要适用于复发或化疗耐药性的B细胞型的非霍奇金淋巴瘤。由罗氏制药公司生产的美罗华(Rituximab)对CD20阳性的B细胞淋巴瘤有肯定的疗效,尤对初治或复发的低度恶性或滤泡型淋巴瘤疗效显著而不良反应轻微。对CD20阳性的其他NHL亦可能取得较好疗效,且其全身毒性轻,是一个有前途的抗肿瘤新药。美罗华与化疗联合应用可进一步提高疗效[4]。

三、单克隆抗体偶联物

1、化学免疫偶联物

单抗药物具有更高的疗效, 通过药物分子上特殊的功能集团如羟基、巯基、氨基将化疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物的其目的是提高药物的靶向性。

有以下优点

(1)利用载体的靶向以及提高肿瘤部位的有效药物浓度,提高了药物疗效

(2)少了药物剂量

(3)降低毒副作用。由抗人体肿瘤的单抗与药物构成的化学偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。曾与单抗进行偶联并在裸鼠进行疗效观察的抗癌药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、顺铂以及长春碱类衍生物等。使用的肿瘤模型包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和白血病等。Mylotarg是由抗CD33分子的单抗和抗肿瘤抗生素calicheamicin连接的偶联物,在抗肿瘤单抗药物中,是第1个于2000年获批准上市的药物与单抗偶联物de Vetten[12]等用抗CD33-Calicheamicin偶合剂(gemtuzumab ozogamicin, CMA-676)治疗1例Ph’染色体阳性AML,用CMA-676单独用药2次,即获细胞形态学和细胞遗传学水平的CR,用实时PCR的方法检查,发现该制剂可杀灭骨髓内3个log的肿瘤细胞。。

2、放射免疫偶联物

将放射性核素连接在单抗上称为放射免疫偶联物是一个在肿瘤细胞检测和相比只用非结合型单抗而增强细胞杀灭效应的广泛研究策略。这个方法的优点在于通过“串扰”(crossfire)效应能杀死包括邻近抗原阴性细胞。如果放射性核素与抗原抗体复合物一同被细胞“内在化” ,则会很快被清除。因此在设计放射性物质结合型单抗时,人们常选择不会被“内在化”的靶抗原,如抗原CD2 0,或选择不会被“内在化”的核素,如90y。有关放射性物质结合型单抗的临床研究主要集中于淋巴瘤和AML。

(1)淋巴瘤:在淋巴瘤的治疗中,理想的核素不仅能作用于与单抗结合的肿瘤细胞,还能通过“串扰”效应杀伤邻近肿瘤细胞及某些表面抗原阴性的肿瘤细胞,且对某些血液循环较差的肿瘤团块内部的细胞也有杀伤作用,核素通常选择发射β射线的1 3 1I和90y。

(2)AML:因为CD3 3 抗原与抗体结合后很快被“内在化” ,因此如选用CD3 3 为靶抗原,则需选用不会被“内在化”的核素90 Y。因α射线的能量是β射线的几百倍,且作用范围小,理论上对周围细胞无影响,即“串扰”现象少,用于白血病的治疗可提高杀伤的特异性。将放射α射线核素2 1 3Bi与CD3 3 单抗连接成为2 1 3Bi-HUM195,药代动力学和剂量分析发现其生物学分布极佳。2002年2月Zevalin在美国获批准,是第1个上市的放射免疫偶联物。

3、免疫毒素

免疫毒素是一种导向性药物, 它是由生物来源的毒蛋白和抗肿瘤抗体偶联而成,一些细胞表面抗原与相应抗体结合后,会迅速被“内在化”。因此,将单抗与毒素连接,通过抗原与抗体的特异性结合,将毒素连同抗原抗体复合物一并“内在化”进入细胞,发挥其阻抑蛋白质合成或破坏DNA结构等作用。将癌细胞或病变细胞杀死,而很少伤害正常组织。肿瘤通过自泌血管内皮生长因子(VEGF)促进血管生成。Arora等[3]发现抗VEGF的白喉毒素能完全抑制纤维生长因子介导的新血管生成,而且能大大减缓裸鼠的Kapos瘤的生长。现在的重组毒素可以被认为是第三代免疫毒素,它们是通过基因工程方法将抗体功能区如Fv、Fab或生长因子的基因与突变形式的毒蛋白基因融合表达产生的。由这种方法制备的免疫毒素在一定程度上克服了用化学法制备的免疫毒素所存在的产率低、分子大、免疫原性大、组成不均一的缺点,使免疫毒素向实用方面迈进了一大步。

4、抗体导向酶-前体药物疗法(antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT)

即前体药物的专一性活化酶与单抗交联,导向输入到靶细胞部位,继而注入前体药物,相应的酶在靶部位把前体药物转化为活化型药物。药物在输送过程中为非活化型,在靶部位转化为活化型,从而可以降低药物毒性并提高肿瘤疗效。鉴于前体药物多为小分子物质,可自由通过各种组织屏障及肿瘤微血管,在肿瘤组织有较高的浓度,加之酶的专一性和扩大效应,使杀伤力明显增强。目前用作前体药物的抗癌药有氮芥、鬼臼乙叉甙、阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤等。作为活化前药的导向酶有β 葡萄糖醛酸苷酸、β内酰胺酶、碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酞酶、胞嘧啶脱氨酶和胸腺嘧啶核苷酶等。这个策略可以克服几个有关抗体-药物、抗体-毒素相偶联的局限,比如:药物低效能、在肿瘤组织中的不对称分布、内在化的需要、抗原异质性等。目前此研究国外正处于发展与完善阶段,国内也已有报道。如用前体药物甲氨喋呤-α-苯丙氨酸和甲氨喋呤-α-精氨酸联合抗人精浆蛋白单克隆抗体-羧肽酶A偶联物对前列腺癌荷瘤裸鼠模型进行肿瘤生长抑制及药物动力学的观察发现,ADEPT治疗组肿瘤生长明显抑制,裸鼠生存时间延长,生活质量优于单用MTX组

四、其它

1、抗体-细胞因子融合蛋白

抗体-细胞因子融合蛋白是基因工程技术发展的产物,它既包括了抗体对肿瘤相关抗原的特异性,又有细胞因子的生物学活性。它能在肿瘤微环境中浓缩细胞因子,从而加强细胞因子的作用并减小毒副作用。除此之外,能直接提高抗体的肿瘤杀伤作用并加强宿主对肿瘤的免疫反应。在动物肿瘤模型中,抗体-细胞因子融合蛋白能靶向杀伤肿瘤并表现出显著的抗肿瘤作用甚至完全除去肿瘤。利用DNA重组技术制备具有抗体功能的融合蛋白是新的发展趋向。融合蛋白一般兼有低免疫原性和分子小型化的特点。Penichet等用荷皮下种植瘤的小鼠连续5d用10μg131 I-抗-IDIgG3-IL2腹膜内注射,得到更好疗效,无瘤生存率达到87%,IL-2仅有2/8的肿瘤鼠无瘤存活(25%)。而抗HER2/neuIgG3-IL-2融合蛋白能显著抑制鼠皮下生长的CT 26-HER2/neu肿瘤,提示该蛋白可用于治疗表达HER2/neu的肿瘤[7]。此外还有其它抗体-细胞因子融合蛋白如Ab-(GM-CSF)和Ab-IL12融合蛋白还处于早期的实验阶段。

2、微型双特异性抗体

近些年来,许多体外和体内实验都证明双特异性抗体(bispecific antibodies)(可同时与靶细胞及杀伤性T细胞结合) 或将单抗与超抗原结合形成复合物用于血液系统恶性肿瘤的治疗,通过双特异性抗体或超抗原增强杀伤性T细胞对靶细胞的杀伤作用。可有效地介导效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞。Kipriyanov等[8]构建了抗CD3/抗CD19微型双功能抗体,体外实验表明该微型双功能抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。Arndt等[9]构建了抗CD16/抗CD30微型双功能抗体,裸鼠体内治疗实验表明,该微型双功能抗体具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性。我们已经构建了抗CD3/抗CD20微型双功能抗体(diabody)并获得较高表达,我们进一步发现抗CD3/抗CD20微型双功能抗体在体外和体内都能介导激活的T淋巴细胞特异性导向杀伤肿瘤细胞。以上结果证明,微型双功能抗体是一种具有很大潜力的治疗B细胞恶性肿瘤的方法。

五、结束语

单克隆抗体技术治疗肿瘤从实验室和临床试验到成为主流临床应用仅仅是近20几年的事。近年来单克隆抗体技术抗肿瘤导向治疗研究已经取得了长足的进步,从以非结合型单抗为主逐步发展出多种新型的导向治疗策略,如前体药物疗法、微型双特异性抗体等。单抗导向治疗肿瘤正逐步成为化疗、放疗及骨髓移植的有效辅助治疗措施。我们在这里讨论的同时,几个新的方法可能很快被肿瘤临床治疗已采用。随着新单抗的不断研制成功以及基因工程技术的不断创新和发展,制备供治疗用的单抗药物将越来越多。

我们也在早期以单抗为基础的临床试验中得到了许多教训和发现了一些问题。由于不同类型的肿瘤具有不同靶抗原,而且对毒素及放射性核素的选择均不同,同一单抗对于具有相同靶抗原的不同肿瘤疗效完全不同。每一种方法都优点与缺点并存。此外单抗与其它治疗方法联合应用的效果、给药最佳时机、给药途径等均有待进一步确定。如何寻求新的分子靶点,提高单抗导向的特异性,增强其杀伤肿瘤细胞的能力,提高恶性肿瘤的临床疗效,最终达到真正治愈的目标。又如何实现单抗人源化,从而大大减轻恶性肿瘤治疗的毒副作用,以及降低费用,将是进一步研究的方向。

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