免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
　　免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

　　胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。
　　１、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
　　２、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其１％水溶液在４℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。
　　金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5～10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。
　　３、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：
　　取0.01％氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。
金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶。

表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响
１％柠檬酸三钠ml 0.3 0.45 0.7 1 1.5 2
金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙
吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518
径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15
４、柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法如下：取 4ml１％柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（体积与鞣酸加入量相等），以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60℃，然后迅速将上述柠檬酸－鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需0.5～1小时)后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾５分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。
　　５、白磷还原法：在120ml双蒸馏水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。
要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（ＣＶ）可小于１５％。

　　１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
　　一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
　　２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，５分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。
　　３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
　　下述标记步骤最为常见：
　　①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
　　②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。
　　③加入5ml１％PEG20000溶液。
　　④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
　　⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 Ａ1cm/540nm=1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
　　⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1％ＢＳＡ的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以Ａ蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
　　以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。　　

　　胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。
　　金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。
　　当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。

根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法
    （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。
（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
2．鞣酸—枸橼酸钠还原法
A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。
B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。
将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。
表 鞣酸—枸橼酸钠还原法试剂配制表
金粒直径
（nm） A液 B液
 1％HAuCl4 双馏水 1％枸橼酸三钠 0.1Mol/L K2CO3 1％鞣酸 双馏水
5 1 79 4 0.20 0.70 15.10
10 1 79 4 0.025 0.10 15.875
15 1 79 4 0.0025 0.01 15.9875
3．制备高质量胶体金的注意事项
（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。
（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。
（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。
（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。
（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。

胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1．待标记蛋白溶液的制备  将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备  以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
3．胶体金与标记蛋白用量之比的确定
（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。
4．胶体金与蛋白质（IgG）的结合  将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。
5．胶体金标记蛋白的纯化
（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
（2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1／5～1／10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1％BSA，0.05％NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。最终可得到70％～80％的产量。
6．胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。
（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。
（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

（一）材料与试剂
1．抗原  牛结核PPD。
2．血清  待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。
3．硝酸纤维膜  孔径0.45µm。
4．氯化金（优质）
5．0.2Mol/L PB液
6．0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液
7．硝酸银显影液（现用现配）
   明胶（20g/L）                  6.00ml
   对苯二酚（57.90g/L）            3.00ml
   硝酸银（25g/L）                0.20ml
   pH3.5柠檬酸盐缓冲液            1.00ml
对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例依次混合。
pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制：
柠檬酸（C6H8O7•H2O）                   25.50g
柠檬酸三钠（C6H5Na3•2H2O）              3.50g
去离子水                加至            100.00ml
溶解后即可使用。
8．定影液
   硫代硫酸钠（Na2S2O3）                   20.0g
   去离子水             加至            100.00ml
   溶解即可。
9．兔抗牛IgG抗体。
（二）操作方法
1．胶体金的制备  试验用水均要求三蒸馏水并过去离子柱，最终去离子水的电阻大于100万Ω。所有容器最终均用去离子水清洗。
（1）采用鞣酸—枸橼酸钠还原法制备
  A液  1％HAuCl4                     2.00ml
        去离子水                      158.00ml
  B液  1％枸橼酸钠                    8.00ml
        0.1％Mol/L K2CO3               0.20ml
        1％鞣酸                       0.20ml
        去离子水                      31.60ml
将A液和B液分别于60℃水浴30min，并不时搅拌，迅速将B液加入至A液中，搅拌，颜色为深蓝色，继续加热至100℃，5 min～10min，溶液颜色变为深红色，自然冷却后4℃保存。
（2）胶体金鉴定：外观呈深红色、晶莹透亮，迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为10nm，颗粒大小一致，分布均匀。
2．胶体金与兔抗牛IgG用量比例的确定  每ml胶体金所需的最低稳定蛋白量是30µg，根据试剂用量增加20％，所以每ml胶体金所需的最低稳定兔抗牛IgG量为36µg。
3．金标记兔抗牛IgG的制备  取所需量的兔抗牛IgG，加入少许去离子水，用0.1Mol/L K2CO3溶液调pH值为9.0（用精密pH试纸测定），同时胶体金溶液的pH值也调至9.0。在磁力搅拌下，将20ml胶体金溶液加入至兔抗牛IgG中，继续搅拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作为稳定剂，以使其最终浓度达到0.05％，再搅拌15min后，置4℃冰箱保存备用。
4．金标兔抗牛IgG的纯化  将金标记的兔抗牛IgG以2 500r/min离心15min，以除去胶体金的聚合物，取上清以65 000g离心1h，可见离心物分为三层，上层为淡黄色，含有未结合的兔抗牛IgG，下层为近黑色，是尚未结合的胶体金颗粒,最主要的中间层为红色，是结合良好的金标记的兔抗牛IgG，倾去上层，收集中层液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原体积的1／10，过滤除菌，分装，4℃保存备用。
5．金标记兔抗牛IgG的鉴定
（1）颗粒大小及均匀度鉴定：取少许金标记的兔抗牛IgG，负染，电镜观察颗粒大小及均匀度，并测量粒子直径大小。
（2）活性鉴定：将牛IgG点样于硝酸纤维膜上，直接加金标兔抗牛IgG抗体，应显示出明显的粉红色斑点。
6．正式试验程序
（1）点样  以打孔器将微孔滤膜制成直径3mm的膜片。将牛结核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀释为40µg/ml，用微量加样器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。
（2）封闭  将膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤1次，用滤纸吸干。
（3）加待检血清  待检血清以PBST液做1︰160倍稀释。将膜片浸入其中，37℃作用1h，其间振荡数次。取出后，以PBST液洗涤后，滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。
（4）加金标抗体  以PBST液将金标液作1︰10稀释，将膜片浸入其中，37℃作用2h，中间振荡数次。
（5）银染  将膜片从金标液中取出，于去离子水洗涤3次，每次3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中，室温下作用10min，移入定影液中，室温作用5min。然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。
（三）结果判定：
＋＋＋～＋＋＋＋ ：呈棕褐色或黑色斑点，着色深，均匀一致，与背景反差大。
＋＋             ：着色较深或着色很深，但背景色也较深。
＋               ：  着色淡，或着色较深，但有背景色。
－               ：  没有着色，或与背景色没有反差。
出现“++”以上，判为阳性结果，否则判为阴性结果。

　　１、胶体金在电镜水平的应用
　　胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。
　　胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。
　　金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。
　　实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。
　　２、胶体金在光镜水平的应用
　　胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。
　　胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。
　　３、胶体金在流式细胞仪中的应用：
　　应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。
　　４、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。
　　５、免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、ＲＩＡ）进行定量。
　　免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。
　　利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。
　　由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。
　　６、胶体金在肉眼水平的应用
　　胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul；②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； ③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；④实验结果可以长期保存；⑤时间大大缩短，提高了检测速度。金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。

胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。
1．液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
2．金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。
3．胶体金固相免疫测定法
（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS／IGSS）。
（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。

胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用
　　免疫层析法(immunochromatography)原理是将特异的抗体先固定于硝 酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
　　早孕诊断用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊纸条）的装配：
　　装配方法：在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α－HCG玻璃纤维、已固定有抗β－HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽 度为4mm的条状，即为尿妊用纸条。
　　本法检测速度快，一般一两分钟可出结果；灵敏度高，可达50IU/L；好的试纸条结果也是准确可靠的，这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗β－HCG的特异性。
　　金标尿妊纸条虽然好用，但在使用中也必须注意以下几个方面：一是温度，试纸条虽然可在室温保存，但大批暂时不用的试纸条还是应该放在４℃保存，以免抗体失效，从冰 箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温，然后才打开密封，可避免反应线模糊不清。二是正确操作，一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃端滴入２滴（约１００微升）尿液，或将吸尿端直接插入标本中，深度约１０～１５毫米２０秒，取出后平放，这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法是取尿标本约0.5ml 加入小试管中，然后插入试纸条，待１～２分钟反应带清晰后观察结果。

胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用
　　ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用，特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ELISA法由于操作程序复杂，时间较长，给实验室带来不便。因此出现一步法快速检测试剂盒，虽可提高检测速度，但有出现假阴性结果的弊端。ELISA法需时较长的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间，将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法Dot-immunogold filtration assay)，又称滴金免疫法。
　　快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原＋标本中的相应抗体＋金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体＋标本中待测抗原＋金标记的特异性单克隆抗体显色。
结果判断：快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有以下不同的判定结果。
快速斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，已应用于多种临床检测项目。
　　以上分析可以看出，胶体金标记技术是继三大标记技术之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。

　　免疫层析是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶反应或直接运用可目测的标记物（如胶体金）而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。这种分析技术操作简单快速，分析结果清楚，易于判断，且无须仪器(或只需简单仪器)，因此，非常适用于各级医院、家庭或个人在诊断、保健、体检等方面的运用。

　　一、免疫层析分析原理和运用方式

　　按照检测原理和运用方式的不同，可将免疫层析分成两个系统:一个是Syntex公司推出的商品名为Acculevel的免疫层析法，以酶反应显色为基础，主要用于茶碱、吗啡、苯巴比妥等小分子药物的检测。另一个是复合型免疫层析法，往往以金胶粒或着色乳胶粒等有色粒子作标记物，层析条通过多种材料复合而成。这种层析方法适应面广，可用于多种小分子半抗原和大分子蛋白类物质的检测。

　　1.Acculevel免疫层析分析：以茶碱的检测为例。Acculevel层析分析主要包括了三种试剂: 包被有茶碱抗体的试纸条、含有葡萄糖氧化酶和茶碱-牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶复合物（茶碱-BSA-HRP）的反应溶液、含有葡萄糖和4-氯-1-萘酚的底物显色溶液。其中的酶反应如下：

　　葡萄糖+O2( 葡萄糖氧化酶 )/()→葡糖酸盐+H2O2

　　H2O2+4-氯-1-萘酚(过氧化物酶)/()→H2O+显色物质

　　Acculevel层析分析的操作步骤：在含有葡萄糖氧化酶和茶碱-BSA-HRP的溶液中加入待测样（全血或血浆），将试纸条下端置于溶液中，溶液中的茶碱-BSA-HRP、茶碱、葡萄糖氧化酶均在毛细作用下向上泳动，同时，溶液中的茶碱和茶碱-BSA-HRP与纸条上抗体发生免疫反应，当溶液迁移到试纸条上端后，加底物进行显色，纸条上颜色的高度与样品中茶碱的浓度呈正相关。上述整个过程约10分钟。

　　在Acculevel 试验中，颜色的高度可用比移度（Rf)表示。若将Rf定义为待测抗原上行距离与溶液上行距离的比值，则下述关系近似成立：

　　Rf=(［Ag0］)/(［Ag0］+［Ab0］)

　　式中［Ab0］为固定在纸条上的抗体量，［Ag0］为待测抗原(如茶碱)的量

　　上式表明，低的抗体固定量和高的抗原浓度使层析条显色高度增加。因此，可根据待测物浓度合理设定抗体包被量。同时，待测物检测下限与抗体包被量相关，若要获得高灵敏度，在保证包被抗体与反应膜牢固联接的条件下，在考虑到检测范围的同时，应尽量减少抗体包被量。

　　以Acculevel试验对小分子半抗原如茶碱作定量测量具有与酶放大免疫测量（EMIT）相似的准确性、精密性和灵敏度，但其简单、快速、无须仪器的特点却是EMIT法所不具备的。而且，由于待测物的定量是以试纸条上的颜色高度为依据，而不以酶活性为依据，故其测量结果基本上不受酶稳定性以及样品基质(matrix)、pH值、温育时间和温度等环境因素的影响，具有很好的重现性。

　　2.复合型免疫层析分析：目前市售的大多数免疫层析产品均属于这种类型。同Acculevel免疫层析相比，复合型免疫层析固相材料往往以玻璃纤维膜、硝化纤维素膜、吸水纸等多种材料复合而成，而不是采用单一的试剂条。其受体(抗体、链亲合素等)往往以点或线的形式包被于检测带，而不是包被整个层析条，并且层析条上往往还吸附有干态的可快速溶解并具有良好层析特性的标记或非标记抗体。复合型免疫层析检测也以层析过程中高特异性免疫反应为基础，但其对分析结果的判断是以受体包被的检测带是否显色，而不是以色带高度为依据。

　　复合型免疫层析法一般采用下述四种方式(附图)。

　　图A中检测带为抗体1-待测物-金标抗体2；图B中检测带为链亲合素-生物素化抗体2-待测物-金标抗体1；图C中检测带为pAb1-待测物-mAb2-金标抗体2；图D中检测带为抗体1-待测物-金标抗体2

附图　复合型免疫层析法的四种常见方式

　　方式A是复合型免疫层析的常用方式。以尿人绒毛膜促性腺激素（HCG）的检测为例: 方式A中抗体1与抗体2分别对应两株配对性良好的抗HCG mAb1和mAb2。检测时，加样区的尿样在毛细作用下向上泳动，首先溶解金标抗HCG mAb2，并继续向上泳动，最后到达膜上端的吸水纸。若尿样中含HCG激素，层析过程中，HCG便首先与金标mAb2结合。当其泳动到固定有HCG mAb1的检测带时，金标mAb2-HCG复合物便与mAb1反应形成夹心结构(mAb1-HCG-金标mAb2)并富集在检测带上，肉眼可观测到一条胶体金特有的红色线条，表明阳性结果。整个检测过程只需一次加样，2～15分钟可得检测结果。B、C、D 各方式的检测原理与此相似。

　　方式B以链亲合素固定于检测带，此方式有以下优点： （1） 固定于检测带的链亲合素可与各种生物素化抗体结合，具有通用性。（2）链亲合素的四价性，使其固定于膜材料后仍能保持较高的对生物素化抗体的反应活性。（3）链亲合素与生物素化抗体结合的高度稳定性。这些特点有利于提高免疫层析的检测敏感度和重现性。

　　方式C的标记物为金标二抗，其优点在于:（1）mAb2以可溶性干态吸附于层析条，从而保证了其对特定抗原完整的免疫反应亲和性和特异性。（2）层析过程中，mAb2与金标二抗可发生一定程度的聚集反应，从而使每个HCG分子可复合更多的金标记物。（3）免疫复合物中mAb2处于HCG与金标二抗之间，使体积很大的金标记物与HCG之间距离增加，从而减少了HCG与检测带多抗发生免疫反应的空间位阻。上述三因素都有利于检测灵敏度的改善。

　　方式D是一种比较早期的免疫层析技术，它在检测原理上与上述A、B、C三种方式相似，但在层析之前要求预先在小池中完成一步免疫反应，使用时稍嫌复杂。

　　二、免疫层析条制作关键技术

　　免疫分析固相技术是免疫层析条研制的关键，包括层析材料的选择、化学处理以及受体在层析膜上的固定等方面。可选择的层析材料有尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、纯纤维素膜、 玻璃纤维膜、硝化纤维素膜等多种类型，但硝化纤维素膜(NC膜)运用较多，这主要得益于NC膜的两个特性：高的蛋白吸附容量及其良好的亲水性所赋予的NC膜的快速层析特性。纯纤维素膜和羧化纤维素膜也是免疫层析的常用材料，但一般要求预先对其作化学处理，使其具有与受体蛋白(如抗体)共价连接的特性。常用的处理方法有苯醌法、溴化氰法和碳二亚胺法，分别如下式(1)、(2)和(3)：

　　无论采用物理吸附还是共价连接，对于固定于检测带的受体，要求具备如下几种性质:（1）受体与膜材料之间结合稳定性好；（2）足够的配体（如抗原或生物素化抗体)俘获容量；（3）简单的重现性好的受体固定工艺；（4）受体的固定不影响层析膜的毛细特性；（5）固相受体优良的贮存稳定性以及膜剩余吸附位点的有效封闭。而对于以干态吸附于流动带的标记或非标记抗体，其可流动性是评价其性能优劣的主要指标，往往要求在流动带加入高效助溶试剂，从而使吸附于流动带的抗体具有快速溶解的特性，使其在层析过程中具有接近于1的比移值。

　　层析材料的选择、处理以及受体固定是免疫层析条研制的关键技术，然而，与此相关的其他内容，如抗体的筛选和纯化、标记物制备、助溶试剂的选择等，也是免疫层析条研制的重要环节。