生命经纬知识库 >>所属分类 >> 免疫学技术   

ELISA PROTOCOL(Yale University)

标签: ELISA PROTOCOL

顶[0] 发表评论(65) 编辑词条

1. Materials

(1) TS Buffer: 10 mM Tris pH 8.0 150 mM NaCl

(2) TST Buffer: TS Buffer with 0.05% Tween-20

(3) Alkaline Phosphatase Buffer: 50 mM NaCarbonate 1 mM MgCl2 (Bring to pH 9.8 with 1 N HCl)

(4) AP Substrate: p-nitrophenyl phosphate (5 mg/tablet)。 Sigma Cat.# N9389

(5) AP-conjugated secondary Ab: AP-Rabbit anti-mouse IgG(Zymed).  Reconstitute  in  ddH2O  as prescribed by manufacturer and aliquot and store at -70 °C.

(6) 100 mM EDTA pH 8.0

2. Protocol

(1) Add 50 µl of antigen to each well of the ELISA plate. I use a 1µg/ml of purified Sec4p most antigens will work in the 1-10 µg/ml range, but you need to determine this emperically. Allow the antigen to bind to the wells at room temperature for 1-2 hours or overnight at 4 °C.

(2) Discard antigen solution by flicking into sink and then placingupside-down onto Kimwipes. Wash 1X with 100 µl TST Buffer. Add 200 µl TST with 2% BSA to block. Incubate at room temperature for 1 hour.

(3) Discard block solution and add 50 µl monoclonal cell culturesupernatants directly or add the same volume of sera diluted in TSTw/ 1% BSA. Incubate 1 hour at room temperature.

(4) Discard the primary antibody solution and wash 3X with TST.

(5) Add 50 µl of diluted secondary antibody conjugated to AlkalinePhosphatase. I use a 1:500 dilution of rabbit anti-mouse IgG(Zymed)。 Incubate at room temperature for 1 hour. About 15 minbefore the end of the incubation start dissolving the p-nitrophenylphosphate substrate tablets. For each ELISA plate dissolve 1 tabletin 5 ml of AP Buffer.

(6) Discard the secondary antibody solution and wash 3X with TST.

(7) Add 50 µl per well of the p-nitrophenyl phosphate solution andincubate at room temperature for 10-30 min. Stop the reactions byadding 50 µl of 0.1 M EDTA pH8.0. For screening monoclonals it isbest to let them go until all of the positives are clearly visible,however if you want to be quantitative it is important not to letthem get intensely yellow or they will be off scale--the plate readeris most accurate when the wells have just begun to clearly turn yellow. 

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇体液免疫功能的检测 下一篇原位免疫PCR的IHC增敏方法

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条