[器材和试剂] ● PCR试剂和设备 ● 含有起始scFv的pHENl质粒或单链DNA(ssDNA) ● Wlzard PCR纯化试剂盒(PrOli]egs.) ● PdSEQl引物 ● 定制BACK引物。本实验方案中,该引物是scFvVlBACK引物:5'-AGC GCC GTG TAT TTT TGC GCG CGA CAT GAC GTG GGA TAT TGC-3' ● 用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备 ● BssHⅡ限制性酶(NEB) ● 用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌的试剂和设备 ● 来自3个VH基因片段噬菌体文库的质粒DNA [方法] 1. 配制50ul PCR反应混合液,包含: ● 水,34.5ul ● 20×dNTP(每种5mmol/L)。 2.5ul ● 10×Vent聚合酶缓冲液,5.0ul ● FdSEQl引物(10pmol/u1),2.5ul ● scFvVLBACK引物(1opmol/u1),2.5/ul ● scFv模板DNA(50ng/ul), 2.0ul ● VentDNA聚合酶(2单位),1.0ul 2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃5分针。 3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次,扩增VH基因。 4. 用Wizard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。 5. 用BssHⅡ和NotI消化PCR产物。 由于用BssHⅡ替代了NcoI,因此实验方案需要调整:首先在37℃用NotI消化,再加入BssHⅡ并调整温度至50℃。 6, 制备受方VH基因片段文库载体;但用BssHⅡ/NotI消化载体,应按上述步骤5进行调整。 7. 连接已消化的VL基因片段PCR产物和已消化的VH基因片段噬菌体文库载体,并电转化到大肠杆菌TGl中,构建重链改组文库。 |
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