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标签: 聚乙二醇(PEG) 沉淀实验 CIC

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聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种无电荷的直链大分子多糖,可非特异性地引起蛋白质沉淀。沉淀具有可逆性,被沉淀的蛋白质生物活性亦不受影响。不同浓度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白质,在pH值、离子浓度等条件固定时,蛋白质分子量越大,用以沉淀的PEG浓度越小。由于PEG6000对蛋白质沉淀具有良好的选择性,所以在IC测定中主要采用PEG6000。

PEG使IC沉淀的机理可能在于使其自液相中空间排斥而析出,此外,PEG还可抑制CIC解离,促进CIC进一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。在被检血清中加入低浓度PEG,可将血清中的IC沉淀下来,利用透光率比浊或散射比浊法可测出CIC的存在与含量。本法简便易行,国内已广泛应用。

1、试剂

(1)0.1mol/L pH8.4硼酸盐缓冲液(borate buffer solution,BBS) 硼酸(H3B03)3.40g,硼砂(Na2B407·10H20)4.29g,蒸馏水溶解后,加至1 000mL。用G3或G4玻璃滤器过滤。

(2)PEG-NaF稀释液 PEG6000 40.9g,NaF 10.0g,用BBS溶解后加至1000mL,用G3或G4玻璃滤器过滤。

(3)热聚合人IgG 将人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加热15rain,立即置冰浴内,冷却后过Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱,收集第一蛋白峰。所获热聚合人IgG可用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。也可取人IgG(10mg/ml)10ml,搅拌下滴加1.8%戊二醛100uL,24h后加入0.4mol/LpH5.4,Tris-HCl缓冲液100uL终止反应,过Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱,用0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液洗脱,收集第一蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%,分装后-40℃保存。试验中可用作阳性对照和制备标准曲线。

2、操作步骤

(1)取待测血清0.15ml,加BBS0.3ml(1:3稀释);

(2)按表10-1加入各液(待测血清最终稀释倍数为1:33,PEG最终浓度为3.64%);

(3)将测试管及对照管置37℃水浴60rrfin;

(4)分光光度计在波长495nm测吸光度,用对照管调零。

3、结果判断

待测血清浊度值:(测定管吸光度—对照管吸光度)×100。以大于正常人浊度值的均值加2个标准差为CIC阳性。

参考值:4.3±2.0,以大于或等于8.3为CIC阳性。或以不同浓度热聚合人IgG按以上方法操作制备标准曲线,根据待测血清吸光度值查标准曲线,即可得IC含量(相当于热聚合人IgG的ug/mL)。

4、注意事项

(1)低密度脂蛋白可引起浊度增加,故应空腹采血;

(2)高丙球血症或血脂含量过高及标本反复冻融,均可导致IC检测出现假阳性;

(3)此法快速、简便,但特异性较差,较适用于血清标本的筛查。

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