一、原理 葡萄球菌a蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子fc段结合的能力,并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-sepHarose cl-4b 柱上的IgG或不同的IgG亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 二、试剂器材 1、spa-sepharose cl-4b (pharmacia-sigma) 2、磷酸缓冲液0.1mol/l pH8.6+0.02% NaN3 3、枸橼酸缓冲液 0.1mol/l pH5.5 0.1mol/l pH4.0 0.1mol/l pH3.0 分别+0.02% NaN3 4、1mol/l pH9.0 tris-HCl溶液 5、再生缓冲液 (1)0.1mol/l tris含0.5mol/l NaCl调整pH至8.6+0.02% NaN3; (2)0.1mol/l 醋酸钠含0.5mol/l NaCl调整pH至2.2+0.02%NaN3。 三、操作步骤 用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液浸泡SPAF-sepharose cl-4b凝胶,15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶,(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。 ↓ 装柱后用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液平衡。 标本可用硫酸铵粗提物,先10000g离心除去杂质,必要时用0.22μm滤膜过滤,上样前用1mol/l pH9.0 tris-HCl 液调整标本液pH至8.6或对平衡液透析过夜。 ↓ 加样,一般按25~30mg IgG/g湿胶比例加样,室温作用15min,用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液充分淋洗,到淋洗液OD值为<0.02。 ↓ 用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱,流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH5.5;纯IgG2a用pH4.0 ;纯化IgG2b用pH3.0 ↓ 用(2)再生缓冲液洗脱剩余蛋白,洗脱后用(1)再生缓冲液平衡完成再生 ↓ 收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。 四、注意事项 1、PA-sepharose cl-4b凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。 先用10倍柱体积0.1mol/l pH8.6 tris含0.5mol/l NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/l pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/l NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/l pH8.0磷酸缓冲液平衡,4℃贮存。 2、SPA-sepharose cl-4b亲合层析法还可用于 (1)除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性 (2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段 (3)吸收或纯化免疫复合物 3、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgM和IgA也具有与SPA结合的能力。 |
→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条
上一篇牛副结核ELISA 下一篇ELISA实验基本原理
词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
2