1. 溶液准备: PBS ( pH7.4 ) :10mM Na2HPO4 ,1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl 封闭缓冲液:3%BSA-PBS 2. 程序: 1 ) 对石蜡切片进行脱蜡和水化:3×10min 二甲苯,5min 100%乙醇,5min 95%乙醇,5min 80%乙醇, 5min 70%乙醇,3×5min PBS。 2 ) 修复抗原,PBS洗涤三次,每次5min。 3 ) 室温下,将玻片在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡15min封闭内源性过氧化物酶,然后用PBS洗涤三次,每次 5min。 4 ) 加入一抗(用3%BSA-PBS封闭液1:50稀释一抗),37℃湿盒孵育1h。 5 ) 加入Post-blocking室温湿盒孵育30min,然后用PBS洗涤三次,每次5min。 6 ) 加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标二抗,室温下湿盒孵育30min。 7 ) 用PBS洗涤玻片5次,每次5min。 8 ) 按照DAB试剂盒说明添加显色液,避光显色30s-5min。用蒸馏水终止显色反应。 9 ) 苏木精进行复染色3min,用蒸馏水冲洗。 10 ) 立即进行脱水和透明:1×5min 70%乙醇,1×5min 80%乙醇,1×5min 90%乙醇,1×5min100%乙醇,2×10min二甲苯。 11 ) 中性树胶封片。 3. 抗原修复方法: ① 柠檬酸钠法: (a) 把玻片放在玻璃固定架上,再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠(pH6.0)的容器中。 (b) 微波中高火6-8min。 (c) 室温冷却。 (d) 用PBS洗涤3次,每次5min。 ② 蛋白酶K法: (a) 配制新鲜溶液: 25μl 20mg/ml蛋白酶K 2.5ml 1MTris-HCl(pH8.0) 0.5ml 0.5M EDTA(pH8.0) 加水定容到50ml (b) 37℃下,将玻片放在架子上孵育5min(蛋白酶K不要预热)。 (c) 用PBS洗涤3次,每次5min. ③ 尿素法: (a) 把玻片放在玻璃固定架上,再将架子放在盛有600ml 的1M尿素(新鲜配制)的容器中。 (b) 微波10min,20min或者30min,每5min补充一次蒸发掉的水。 (c) 冷却30min到1h。 (d) 用蒸馏水洗涤4次,每次3min,再用PBS洗涤3min。 |
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