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标签: 免疫细胞化学 神经科学 应用

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免疫细胞化学的发展对许多领域的研究起到很大的推动作用,在神经科学的研究中尤为突出。本文仅就免疫细胞化学在神经科学的基础研究方面的应用做一简单介绍。

1、确定神经递质的性质、定性和分布

早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作,但由于技术方法的限制,对神经递质的性质无法确定。1949年Koelle建立了胆碱酯酶染色法(cholinesterase staining method, ChE)1964Rh,Karnovsky 和Roots在此基础上改良并建立了一步完成的乙酰胆碱酯酶(Acetycholinesterase, AChE)直接染色法,使显示胆碱能神经成为可能。从生物测定来看,AchE和胆碱能神经的标志酶存在平行关系。因此,一般认为,在加用乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况下,用AchE 显示胆碱能神经,仍不失为一种简便易行、可信的技术方法。但必须指出的是,一些接受胆碱能神经支配的细胞(称为胆碱能敏感细胞)和一些非神经细胞(如红细胞和骨骼肌)也可呈AchE阳性反应,甚至中枢神经系统内去甲肾上腺素(NA)能神经元集中的部位—蓝斑也呈现AchE阳性反应。因此,AchE阳性反应的不能就简单地确定为胆碱能神经元或神经。

50年代,Eranko就已发现用甲醛水溶液可使肾上腺髓质内含NA的神经细胞发生荧光。瑞典的Falck和Hillarp(1962)在此基础上改良并建立了用冷冻干燥和甲醛蒸汽诱发荧光,1974年Lindvall 和Bjorklund(1974)和de la Torre等(1976)相继建立和改良了乙醛酸诱发荧光法,开展了荧光组织化学的新篇章;为研究单胺类神经递质的定位和分布提供了手段。

70年代以来,免疫细胞化学技术的应用,使我们在对上述经典神经递质研究的基础上又迈进了一大步。与上述方法相比,免疫细胞化学技术具有较高的敏感性和特异性,例如应用胆碱能神经元的标志酶—胆碱乙酰移换酶(Choline acetylase, ChAc)的单克隆抗体就能较AChE法更准确地确定胆大能神经元,同样,应用多巴胺羟化酶(DβH)抗血清能较甲醛或乙醛酸诱发荧光法更为准确地研究NA神经元及其通路,而且不需借助显微分光光度计测定各种单胺递质呈现荧光的不同波长加以区别,免疫细胞化学应用不同的标志酶免疫染色就可区别各种神经元和/或确定神经元内所含的不同的神经递质。如DβH免疫反应阳性在哺乳动物即可做为NA能神经元的标志,因为哺乳动物不存在其它合成NA的酶,所有合成NA的部位均有DβH。酪氨酸羟化酶(TH)和多巴脱羧酶(DDC)阳性表示多巴胺(DA)能神经元系统,而TH、DDC、DβH和苯乙醇胺位甲基移酶(PNMT)免疫反应阳性即为肾上腺素(E)能神经元系统。

借助免疫细胞化学技术,至目前为止,还发现了有40种以上的神经肽分布于中枢神经、下丘脑、垂体、松果体、脊髓、神经节及外周神经系统特定的神经元中。在脊椎动物,这些肽类物质在体内的分布呈多位性,不局限于神经组织或神经内分泌系统,如原先在脑或下丘脑、垂体中提取的神经肽如脑啡肽(ENK)、生长抑素(SOM)和血管活性肠肽(VIP)等也存在于消化道的内分泌细胞和壁内神经丛中,反之,一系列先从胃肠道分离的肽类激素如胆囊收缩素(CCK)、P物质(SP)等也在神经组织中发现,如CCK在人和猪大脑皮质含量非常丰富,达11 nmol/g脑组织,P物质在脑中30处以上的地方存在,这些多肽被称之为脑肠肽(brain gut peptides)。在外周器官如消化道、呼吸道中的肽类物质统称为调节肽(regulatory peptide),包括存在于消化道与呼吸道等器官内分泌细胞内的多肽(在消化道又称胃肠激素)和存在于器官壁内神经丛中的神经肽。虽然神经肽,包括脑肠肽在机体中的确切生理作用还有待研究,是作为神经递质、神经调制物(neuromodulator)或神经激素(neurohormone)或二者兼而有之,还存在争论。但免疫细胞化学在神经科学中的应用已为我们开辟了一个新的研究领域,它确定在机体中除传统的胆碱能神经和肾上腺素能神经以外还存在第三上分枝—非肾上腺素能非胆碱能神经(non—adrener-gic non –cholinergic nerves,NANC)。Bloom等认为这第三种神经成分其末梢释放的递质是多肽类物质,又称肽能神经(Peptidergic nerves)。研究结果表明,机体全身的各个器官内都有不同种类和不同数量的肽能神经分布。在大鼠和丘脑下部、杏仁复合体,延脑内一些神经核和脊髓后角内均有较多的肽能神经元和纤维,小脑内仅有散在的肽能神经纤维,而大脑皮质内多数神经肽缺如,仅发现有CCK、SOM和VIP等数种。在消化道,存在一个壁内神经系统,Langley 称为胃肠神经系统(Enteric Nenvous ystem),现已发现其中含有VIP、SP、ENK、SOM等20余种神经肽,其它各脏器中也都有肽能神经分布。

2、探查和发现新的神经递质

免疫细胞化学可作为组织探针(Histological probe),不断探查和发现新的神经递质。除上述的乙酰胆碱及其合成酶、肾上腺素及其合成酶、活性多肽以外,还可用以确定其它的疑义神经递质(Neurotransmitter chemical suspect)的性质和分布,包括5-HT及其有关酶类、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、天门冬氨酸和牛磺酸等。

近年来,重组DNA工程与免疫细胞相结合而发展起来的原位杂交免疫细胞化学(In situ hybridization Immunocytochemistry)作为组织探针,在发现神经系统特有的蛋白质和肽类方面。具有更高的特异性和灵敏性。重组DNA工程系列用制备的脑的多聚腺苷酸的mRNA,反转录为互补DNA(cDNA),克隆后与组织切片中的mRNA杂交,再按其cDNA核苷酸顺序推断出氨基酸顺序合成新的多肽,以此作为抗原,制备抗血清进行免疫细胞化学的研究,以发现新的神经肽。原位杂交免疫细胞化学技术,简言之,就是利用放射性同位素(或生物素)标记的cDNA片段与组织或细胞中特异的mRNA进行杂交来观察mRNA在体内的分布。发展这项技术,对发现神经系统特有的蛋白质或肽类,具有极大的潜力,如脑内特有的mRNA有30000种,目前已知的数10种神经肽仅占其中的一小部分。

3、追踪神经束的行径及其投射区

免疫细胞化学技术的引入,使神经解剖学追踪神经束的行径及其投射区的研究方法从单纯的采用损毁核团或压榨、切断神经不引起溃变,然后用镀银或其它染色法观察溃变的神经细胞体和末梢这一传统的技术中解脱出来。与70年代的HRP技术和放射性自显影术相比,免疫细胞化学技术不但能追踪神经束的行径及其投射区,而且可以定性,确定神经细胞核团或神经束所含神经递质的种类。量单纯用免疫组化染色在连续切片上追踪,常不能获满意结果,因为神经组织的多肽含量较低,在免疫组化染色的连续切片追踪过程中常有丢失的可能。故现在普遍采用的是免疫细胞化学技术与其它技术相结合的“杂交技术”,如与HRP、荧光物和放射自显影技术等相结合的逆行或顺行标记法、与AChE和单胺荧光组织化学技术相结合的多重染色法等。Westlund在1983年应用DβH抗血清注入脊髓,经轴浆运输到胞体,证明脑桥的NA能神经细胞群是脊髓内NA能神经纤维和终末的唯一来源。利用免疫荧光与荧光素进行标记相结合的方法,Mathy和Hunt查清了过去一直了解得不太清楚的内脏感觉和味觉的传入径路,证明在内脏感觉和味觉由周围感受器传导至感觉皮质,中继部位在延髓的孤束核,脑桥的解剖学工作者还发现用麦胚凝集素(WGA)或霍乱毒素(Cholera Toxin)结合的HRP(CT-HRp),在神经束行径追踪方面,较游离的HRP灵敏数10乃至100倍以上,因为结合的HRP是通过受体介导而被神经元摄入的。万选才等的研究工作表明CT-HRP较之单纯的HRP在显示树突终末状结构方面有很高的灵敏性。结合HRP的优点可归结为四点:①灵敏度高;②剂量低微;③充分、恒定地显示轴突、树突顺行(离胞体)标记;④降解时间长。以古老的切断神经或损毁神经细胞核团的研究方法与免疫细胞化学技术相结合以追踪神经细胞的起源仍在沿用,如Hokfelt在研究小肠SOM免疫反应性神经的来源时发现,切除肠系膜神经后,小肠SOM免疫反应性神经减少,而结扎肠系膜神经后DβH和SOM免疫反应物在结扎的神经近端聚集,说明小肠的DβH和SOM主要是通过肠系膜神经传运来肠壁的。也可采用化学神经阻断剂如6-羟多巴胺(6-OHDA)、红辣椒素(Capsaicin)等代替手术切断,与免疫细胞化学技术结合应用探寻神经束的行径和反射。

总之,免疫免疫化学技术的应用,使能在中枢较前更迅速、准确地显示了一些神经束的行径、神经细胞核团的定位和定性以及外周器官神经纤维的来源等。

4、区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞

免疫细胞化学的发展进一步揭示了神经组织成分的特殊化学性质,利用这些特征不仅能区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞,而且可进一步区分不同的神经胶质细胞。S-100是一种从脑组织提取出来的酶性蛋白,是钙结合蛋白的一种,它主要存在于神经胶质细胞、周围神经的雪旺氏细胞、交感神经节中的卫星细胞和肠肌间神经丛的肠胶质细胞(Entericglial cell)。S-100 也可用于人类肿瘤组织发生的分类,如星形胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤雪旺氏细胞瘤显示S—100免疫反应阳性而脑膜瘤和髓母细胞瘤为阴性反应。神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific Enolase, NSE)是从脑组织分离出的一种酸性可溶性蛋白,是烯醇酶的同工酶之一。NSE是神经元特异性蛋白质,存在于神经细胞和APUD系统的神经内分泌细胞中,可作为神经元和神经内分泌细胞的标志酶,在星形胶质细胞瘤、脑室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤和雪旺氏细胞瘤中,NSE呈免疫反应阴性,而神经母细胞瘤为NSE免疫反应阳性。皮肤的Marker细胞,细胞学分类归属不明,经NSE免疫染色反应呈阳性结果,结合电镜观察证明在该类细胞中含有致密核心的大囊泡,属APUD系统的神经内分泌细胞。在APUD系统的其它细胞如垂体前叶中肽类细胞、肾上腺髓质细胞等以及APUD瘤中,NSE均呈阳性反应。NSE又是神经元分化的标志酶,可以用以研究体内、外神经元的分化发育过程。

近来,免疫细胞化学工作者又利用各种细胞中所含中间丝提纯制成特异性的单克隆抗体血清用于细胞学归属和病理学的检测。这些中间丝包括:①上皮细胞或上皮源细胞中的前角质蛋白(Prekeratin)或称细胞角质蛋白(cytokeratin);②心肌、平滑肌或骨骼肌细胞中的结蛋白(Desmin);③间质细胞或间充质细胞中的波形微丝(Vimentin);④神经胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillory Acidic Protein, GFAP);⑤神经细胞中的神经微丝(Neurofilament, NF)等。实验证明,GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白,具有星形胶质细胞分化潜能的肿瘤如髓母细胞瘤也含有GFAP,而少突胶质细胞和小胶质细胞呈阴性反应。肠道肌间神经丝内胶质细胞原来细胞学分类归类不明,经GFAP染色呈阳性反应,说明其中与中枢星形胶质细胞属于同一细胞学范畴。O1-O4抗原和半乳糖脑苷脂(Galactocerebroside)只存在于少突胶质细胞,griffonia simplicifloia凝集素仅对小胶质细胞呈阳性反应(小胶质细胞膜上有2-d-半乳糖)。据此,可区分不同类型的神经胶质细胞。

总之,免疫细胞化学技术的发展,解决了过去依赖Nissl 、Cajal和Golgi等传统的神经组织染色法所不能完全解决的问题。进一步揭示了神经细胞的特殊化学性质,现在神经组织内已证实的物质包括蛋白质、肽类、酶类、神经递质和胺等不下50余种,其中神经系统的特异性蛋白质有20余种,与神经元有关的除NSE外,还有神经微丝蛋白,微管蛋白,碱性蛋白(只存在于大脑神经元内的一种组蛋白)和只存在于嗅球神经元中的嗅球蛋白等;与神经胶质有关的有:神经收缩蛋白、小泡蛋白、突触蛋白(Synaptin)、GP350和D1、D2、D3等,为进一步研究神经细胞、神经胶质细胞、神经内分泌细胞及其结构成分提供了有力的手段。

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