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免疫磁性微球在分离细胞中的应用

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免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres,IMMS),或称免疫磁珠(Immunomagnetic Beads,IMB),是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。由于需要在磁性微球的表面结合上适当的抗体,因此要求所用的磁性微球能通过其表面的化学基因与单抗结合,或有较大的表面吸附力能与单抗牢固结合。交联聚苯乙烯微球强度高,表面易进行化学修饰,是比较理想的制备免疫磁性微球的骨架材料。

微球与抗体的连接有吸附结合与共价结合两种形式,吸附结合依靠微球表面对抗体的非特异吸附力,而共价结合依靠微球表面的活性基团与抗体共价反应。吸附结合只有在微球具有非常大的表面积时才有可能比较牢固,这样,对于表面比较平整的微球,就要通过对其表面进行处理来提高它的抗体结合力,以保证IMMS表面有足够的抗体。经过表面处理的磁性微球与单抗在适当的缓冲液中培养,抗体通过物理吸附很快地与磁性微球结合,如果微球表面有活性基团,则接下来就会通过较慢的化学反应共价结合在磁性微球的表面。

免疫磁性微球主要用于细胞分离等方面。由于它能特异性地与靶物质结合并使之具有磁响应性,因此将免役磁性微球与含有靶物质(欲分离的物质)的复杂混合物共同培养。则免疫性微球可以通过抗原抗体反应选择性地与靶物质结合,当此化合物通过一个磁场装置时,与免疫磁性微球结合的靶物质就会被磁场滞留,从而与其他复杂物质分离开来。

用于细胞分离的免疫磁性微球具备以下条件:化学性能稳定,不产生凝聚;不与细胞发生非特异性的结合;磁性微球与抗体的结合牢固;磁性微球的大小均匀,磁响应性好,磁性纳米材料的含量均匀一致;磁性微球大小适当,不易被细胞所吞噬。

IMM与细胞的结合可以采取两种方法,直接法和间接法。直接法是指抗体直接连在磁性微球上,然后与靶细胞结合。间接法是指先将细胞与特异抗体混合培养,使特异抗体结合在细胞表面,然后加入预先用抗鼠IgG(二抗)处理的磁性微球。使磁性微球间接地与靶细胞结合。直接法可以减少洗涤和培养步骤,但对IgM单抗很少能使用。间接法与直接法相比,除适当范围广外,还可以使用一组单克隆抗体,因而会获得更好的细胞清除效果。但要经过多次的洗涤步骤,特异性也会有所降低。

针对单核细胞的单克隆抗体的发展使得分离带有特异表面标记的细胞成为可能。一般有3类不同的方法,即流式细胞仪技术(PACS)、表面联上二抗的异体红细胞花环技术、将抗体被动吸附在聚苯乙烯组织养板上的Panning技术。这些技术都有各自的缺点。FACS价格昂贵,技术复杂,经常会被所分选细胞的容量、活性、无菌度等问题所困扰;红细胞花环技术无法处理大量的细胞,另外,至今尚无一成熟、简便的方法能够将抗体偶联至红细胞膜上;Panning技术也有很多局限性,它难与放大操作,步骤烦琐,不能定量,靶细胞经常混杂着非特异抗体吸附在培养板底部的其他细胞。相对而言,免疫磁性微球具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯度高等优点,尤其在操作简便省时方面,其他分离方法很难比拟。

磁珠是细胞分选的关键,以Miltenyi Biotec公司已申请专利的MACS磁珠为例,该磁珠直径只有50nm,相当于一个病毒粒子的大小,只有真核细胞的百万分之一,用扫描电镜也仅能看到细胞表面的磁珠,这种磁珠能形成稳定的胶体溶液,在磁场中既不沉淀也不聚合。磁珠的组成是铁氧化物和多糖,最多只结合细胞表面三分之一的特征抗原。而且由于体积极小,能被细胞降解,且不会激活或影响细胞的功能和活力,细胞的生理功能也不变,因此细胞分离后无需去除磁珠,阳性分选出的细胞(即磁性标记细胞)可立即用于分析和随后的实验。

MACS技术可以分离出非常纯的细胞群体,而且极好的回收率和存活率。依据细胞频率和抗原标志表达水平的不同,分离细胞的纯度可达95%-99.9%、回收率>90%。

MACS技术一步性阳性选择出的细胞数可达109。无论起始的细胞量是105或是1011,都用同一简单的操作过程。磁性标记细胞约15分钟,用分选柱分离磁性细胞只需几分钟时间。可以用不同规格的柱子来随意分选不同数量的细胞。

被磁性标记的细胞可同时用结合有抗体的荧光染料对同样的标志进行染色,从而可对细胞分选作质控和分析。由于MACS的微型磁珠是亚微观的,因此不会影响标记细胞的散射光。经MACS分选的细胞可以直接用流式细胞术来测定其纯度,也可以与荧光显微镜术、PCR或FISH兼容。

MACS技术可以很好地对低达10-8的稀有细胞进行阳性分选。对于那些频率更低的细胞可以联合使用排除法和阳性选择法来进行分离。现在还可以根据细胞的胞浆蛋白或活性细胞的分泌蛋白来进行细胞分离。

磁性细胞分选有两种常用方法:阳性选择法及排除法。阳性选择法是指把目的细胞标记后直接把它们作为阳性的磁性标记的组分分选出来;排除法是指把非目的细胞标记,然后把它们从细胞混合物中去除掉。在后一种情况下,我们主要是要得到非磁性标记的组分。对于不同的实验要按具体情况来决定是用阳性选择法还是用排除法。从异质性细胞的悬液中分离目的细胞最直接的方法就是先把目的细胞特异性标记后把它们分离出来。因为磁珠与细胞表面的结合很少会影响细胞的功能和存活力,所以应首先考虑阳性选择法。用阳性选择法具有速度上和单克隆抗体特异性的优势。在大多数情况下阳性选择法可以为您节约时间和费用。如果您的实验不适合用阳性选择法(例如,细胞可能会被抗体激活,或目的细胞无特异性抗体等),您可以选择排除法,对非目的细胞进行标记,一次排除过程就可以把99.99%磁性标记的细胞排除掉,从而得到高纯度的细胞,

如果您要分离非常稀少的细胞,可以先把非目的细胞从细胞悬液中排除掉,再对富集后的细胞组分进行阳性选择,从而获得高纯度的细胞。这种策略也可用于一些非目的细胞也表达有用来阳性选择目的细胞的抗原时,先去除非目的细胞,再阳性选择所需细胞。

几乎所有单抗或多抗均可用于间接标记。首先用第一抗体标记细胞,这种抗体可以未结合或结合了生物素、荧光素、藻红蛋白及异藻蓝蛋白的,然后用分别结合有抗免疫球蛋白、抗生物素、链霉亲和素、抗荧光素、抗PE等抗体的微型磁珠,对细胞进行磁性标记。间接标记可同时进行荧光染色兼容,以进行下一步的流式细胞术或显微镜分析。一种抗体的混合物可用于同时分离或去除多种类型细胞。间接标记对对磁性标记有放大作用,这可能在使用弱表达标志进行磁性分离时会很重要。

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