问:请问大家提取酵母的总RNA都用什么方法?有好用的试剂盒吗?酵母总RNA提取应该注意什么? 答:使用热酚法抽提酵母RNA,很好用,至今没有失败过。 (1) 将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中,30℃过夜旋转培养。 (2) 稀释过夜培养的菌液,重新在10ml培养基中培养细胞。 (3) OD600达到1.0时,收菌,4000rpm/min离心5min,弃培养基。 (4) 将细胞悬浮于400μl AE缓冲液(50mM Sodium Acetate,10mM EDTA 调整pH值至5.2)。 (5) 加入1/10体积的10% SDS,充分混合。 (6) 加入等体积在65℃预热的酸性酚(pH4.5),混合。 (7) 65℃加热5min,冰上放置10min。 (8) 在室温下8000rpm/min离心10min。 (9) 取水相,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),10000rpm/min离心8min。 (10) 取水相,加入等体积氯仿/异戊醇(49∶1)10000rpm/min离心8min。 (11) 加入1/10体积3M pH5.2的醋酸钠,2.5倍体积的纯乙醇,-20℃过夜沉淀。 (12) 沉淀样品于4℃离心5min,去除液体。 (13) 在冰上干燥RNA(放置15min),最后用适量DEPC水溶解RNA。 |
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