传统的空斑实验方法测呼吸道合胞病毒的PFU值,由于其空斑形成较小,且需要借助特异性的表面融合蛋白抗体来确定,故操作繁琐,费用较高。这里介绍给大家三种简单易行的空斑形成实验操作方法：

方法一

1、以5×10e5/ml的密度接种Hep－2细胞到6孔板中，每孔加入3ml细胞悬液；

2、待细胞长成单层后（不得超过48hr），移去营养液，每孔加入400ul的PBS和100ul毒液（10倍系列稀释）；

3、37℃，5％CO2，吸附1-4h，每隔15－30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀，病毒在4h时达到最高吸附度；

4、弃去吸附液，每孔添加覆盖层3ml，少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5％小牛血清的2×DMEM和0.6％的琼脂糖按1：1比例混合而成，这样小牛血清的终浓度为2.5％，琼脂糖为0.3％。琼脂糖必须高压灭菌，用前以微波炉充分融解，并放置65℃水浴保温待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可，其中还可加入双抗或二性霉素等，过滤除菌备用，用时37℃预热。二者应充分混合且温度不能过高（即无烫手感为止），否则会摧残细胞；

5、37℃孵育6－7天，到时每孔添加约2ml的1％福尔马林（以0.15M的NaCl配制），固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24h以上，无上限；

6、剔除覆盖层，用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖；

7、每孔添加2－3ml的0.05％中性红。贮存液为10×的，可保存数月之久，工作液以去离子水稀释即可；

8、室温染色1h－1d，吸掉染液，轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久；

9、空斑计算方法同其它方法。

参考文献：Jennifer L.McKimm-Breschkin,A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaques without immunostaining,J.Viro Methd.120(2004):113-117

方法二

1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中，每孔1ml，使之24h内能长成单层；

2、以2％DMEM（维持液）10倍系列稀释好毒液；

3、吸去生长液，PBS洗涤细胞1－2次，每孔加入维持液500ul；

4、每孔加入稀释好的毒液50ul，充分混匀，每个稀释度做2个复孔，37℃，5％CO2吸附2h，每隔5分钟摇晃1次平板，以使之分布均匀；

5、微波炉充分融化无菌的3％琼脂糖，65度水浴保温备用，4％的2×DMEM预热至37℃；取1个小培养瓶，分别加入等体积的琼脂糖和DMEM，充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml；

6、室温或4℃放置板子致覆盖层完全凝固，然后将之反扣过来，置37度培养4－5天，每天观察细胞情况，注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水，否则琼脂糖易干裂；

7、取出板子，每孔加入100ul的MTT，37℃孵育4h，则可见清晰的空斑形成，活细胞染成蓝色，选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰，100mlDDW加入250mg配成0.25％浓度，-20℃冻存备用；

8、PFU计算方法同其它方法。

参考文献：见重庆医科大学儿童医院免疫室廉国利博士论文《脱氧核酶在小鼠体内抗呼吸道合胞病毒的效应》。

方法三

1、试验前一天用2×105HEP22细胞接种24孔板。37℃,5%CO2培育过夜。Hanks液冲洗细胞1～2次,用NaHCO3调Eagle MEM的pH值后稀释RSV(10倍稀释) ,然后加入24孔板中(设2个复孔),吸附1～2h,15～30min摇动一次以保证蚀斑分布均匀；

2、以2倍的Eagle内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层；

3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5ml ,冷凝后,倒置于34℃,5d后,用福尔马林固定,0.15 %结晶紫染色,显微镜下数斑;

4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒样品空斑形成单位,a指空斑均数,b指病毒稀释度的倒数,v指病毒量）；

参考文献：邹毅，黄海鹭，徐军，钟南山.小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染.中华结核和呼吸杂志2001年8月第24卷第8期。