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标签: 免疫球蛋白 IgG IgA IgM IgE Fab 多克隆抗体 制备

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免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。
随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

目录

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IgG的分离与提纯编辑本段回目录

 IgG的分离与提纯
(一)材料与试剂配制
1.动物血清
2.硫酸铵饱和溶液
硫酸铵            800g~850g
H2O               1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
3.0.01Mol/L pH7.4PB液
A液:0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O        15.60g
加H2O至            1 000.ml
B液:0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O        35.80g
加H2O至              1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。
4.1%BaCl2溶液
5.纳氏液
HgI           115.00g
KI            80.00g
加H2O至    500.00ml
溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。
6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。
8.透析袋(或玻璃纸)。
(二)操作方法
1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3 000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6. 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
7. 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8. 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9. 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
    10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
    11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。
    12.IgG的纯度鉴定  可采用下列方法之一鉴定。
⑴ 区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
⑷ 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
    13.IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩:参看本章第九节。
⑵ IgG的保存:一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。

 IgG的简易快速提取
    应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。
1. DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。
⑵用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。
⑷于4℃中放置1h,中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的IgG液。
2.DEAE-SephadexA-50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ-G。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ-G无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE-SephadexA-50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ 再用同样重量的DEAE-SephadexA-50处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为γ-G制品。
⑷ DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。


 

IgM的分离与提纯编辑本段回目录

(一)材料与试剂配制
1.血清
2.葡聚糖凝胶G200
3.洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris-HCl+0.14Mol/L NaCl)。
(二) 操作方法
选取2.50cm×90cm层析柱,用葡聚糖凝胶G200装柱,平衡后,直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品,洗脱液洗脱,流速0.25ml/min,分管收集,测OD280值,第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合,浓缩、鉴定。

IgA的分离与提纯编辑本段回目录


 IgA的分离与提纯
(一)材料与试剂配制
1.DEAE52纤维素
2.0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4•7H2O          2.88g
加水至1 000.00ml
3.饱和硫酸铵溶液
4.10%EDTA—Na
5.SephadexG200
6.0.01Mol/L pH7.4PB液
7.0.10Mol/L pH6.4PB液
8.血清
(二)操作方法
1.取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液,调pH至7.0,室温搅拌1h,离心去沉淀。
2.于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置30min或冰箱过夜。
3.10 000r/min离心10min,去上清。
4.取沉淀溶于4ml10%EDTA-Na溶液中。
5.生理盐水中透析除盐。
6.过DE52柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白(IgG)弃去。
7.换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱,收集蛋白峰,即为IgA。
8.再过SephadexG200柱,洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl),收集洗脱液测OD280值,取第一峰即为纯化IgA。
9.透析、浓缩、鉴定。

 分泌型IgA的分离与鉴定
(一)材料与试剂配制
1.初乳
2.SephadexG200
3.0.10Mol/L pH6.8PB液
4.0.01Mol/L pH7.4PB液
5.DEAE52
(二)操作方法
1.取初乳20ml,10 000rpm离心10min,弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。
2.取乳清过SephadexG200柱(柱规格为2.50cm×90cm),以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱,第一峰为IgA(含IgG)。
3. 收集乳液,于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
4. 将透析液浓缩至5mg/ml以上。
5. 过DE52层析柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱,洗下蛋白峰为IgG,弃去。
6. 换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS(0.10Mol/L NaCl)液洗脱,
收集洗脱液 ,即为较纯的IgA液。
7. 必要时,可再过一次SephadexG200柱。
8. 浓缩,鉴定

IgE的分离与提纯编辑本段回目录

(一)材料与试剂配制
1.血清
2.饱和硫酸铵溶液
3.洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液
 0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)
    4.DE52
5.SephadexG150
(二)操作方法
1.取血清倍比稀释后,加等量饱和(NH4)2SO4溶液,盐析。
2.离心取沉淀,溶于少量生理盐水中,透析、除盐。
3.过DE52柱,以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱,收集洗脱蛋白峰(IgG),弃去。
4.换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗下的蛋白峰主要是IgE。
5.透析除盐。
6.过G150柱,以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液即为纯化的IgE。
7. 浓缩、鉴定。


 

连续提取免疫球蛋白法编辑本段回目录

(一)试剂及配制
1.饱和硫酸铵液
2.各种磷酸盐缓冲液
⑴ 0.2mol/L原液
A液:0.20Mol/L NaH2PO4液
 NaH2PO4•H2O              31.20g
    H2O                       1 000ml
B液:0.20Mol/L Na2HPO4液
    Na2HPO4•12H2O             71.7g
    H2O                       1 000ml
⑵ 0.10Mol/L pH8.0PB液
             A液:                       53ml
      B液:                      947ml
      H2O       加至            2 000ml
⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液
 取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml,加H2O至2 000ml
⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液
 取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml,加水至2 000ml。
⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液
 取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml,加水至2 000ml。
⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液
  A:                             920ml
  B:                              80ml
  H2O       加至                 2 000ml
⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液
 a液.0.40Mol/L NaH2PO4液
   NaH2PO4•2H2O                    62.40g
   H2O       加至                   1 000ml
 B液.0.40Mol/L Na2HPO4液
 Na2HPO4•12H2O                   143.4g
H2O       加至                  1 000ml
         取a液                             960ml
           b液                               40ml
           混合即可。
    ⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS液
  取0.10Mol/L pH8.0 PB液             100ml
  NaCl                                8.20g
  H2O       加至                    1 000ml
3.DEAE-纤维素(细粒级)
4.SephadexG200
(二)操作方法
1.取一定量的血清,加等量的生理盐水,然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液,使成40%的饱和度,静置30min。
2.10 000r/min离心10min,去上清。
3.加入一定量的生理盐水,使沉淀溶解,再加入饱和硫酸铵溶液,使成40%饱和度。10 000r/min离心10min,去上清。
    4.再重复步骤3一次。
    5.将沉淀以少量生理盐水溶解,透析,除盐浓缩。
    6.制备DEAE-纤维素柱,以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
       同时制备SephadexG200凝胶柱,以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并进行洗脱。
    7.以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白液为IgG。
8. 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgE,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgE。
9. 以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgA,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgA。
    10.以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脱,洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。
11.以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脱,得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200,收
集第二峰即为纯IgM。

抗血清的制备编辑本段回目录

  有了质量好的抗原,还必须选择适当的免疫途径,才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。
  (一)用于免疫的动物
  作免疫用的动物有哺乳类和禽类,主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等,实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量,如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清,用于免疫的动物应适龄,健壮,无感染性疾患,最好为///雄性,此外还需十分注意动物的饲养,以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔,最好用纯种新西兰兔,一组三只,兔的体重以2~3kg为宜。
  (二)免疫途径
  免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等,一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。
  (三)佐剂
  由于不同个体对同一抗原的反应性不同,而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱,因此常常在注射抗原的同时,加入能增强抗原的抗原性物质,以刺激机体产生较强的免疫反应,这种物质称为免疫佐剂。
  佐剂除了延长抗原在体内的存留时间,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激网状内皮系统,使参与免疫反应的免疫活性细胞增多,促进T细胞与B细胞的相互作用,从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
  常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1:2~9(V/V),这是不完全福氏佐剂,在每毫升不完全佐剂加入1~20mg卡介苗就成为完全佐剂。
  配制方法:按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内,用超声波使之混匀,高压灭菌,置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5~10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另一注射器装佐剂,二者以聚乙烯塑料管连接,然后二者来回反复抽吸,约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。
  (四)免疫方法
  抗原剂量,首次剂量为300~500μg,加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2~3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂,首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml,加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
  在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3ml血,制备血清,检测抗体效价。如未达到预期效价,需再进行加强免疫,直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时,即可放血制备抗血清。
  (五)抗血清的采集与保存
  家兔是最常用以产生抗体的动物,因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血,鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉入血,也可心脏采血。取动脉或静脉放血时,将兔放入一个特造的木匣或笼内,耳露于箱(笼)外,也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开动脉或静脉,血液即流出,每次可收集30~40ml 。然后用棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯。二星期后,可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时,将兔仰卧,固定于兔台,剪去颈部的毛,切开皮肤,暴露颈动脉,插管,放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。
  收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。在无菌条件,吸出血清,分装(0.05~0.2ml),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮存于4℃冰箱保存。
  (六)抗血清质量的评价
  在免疫期间,不仅各个不同的动物,而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化,因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后,才可使用所取得的抗血清。
  1.效价  抗血清的效价,就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法,此法对所有的抗体均适用。某些由大分子(如蛋白类)抗原所产生的抗体,可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。
  (1)放射免疫法: 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合,孵育24h后,测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1:15000,则该血清的效价就是1:15000。抗血清的效价,除由抗血清本身的性质决定外,还受标记抗原的质量、孵育时间,所用稀释液的成分及其pH等因素的影响,在工作中必须引起注意。(测定方法见第8章 )
  (2)双向扩散法:利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散,两者在相交处产生沉淀线,以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
  球脂板的制备:100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内,于水浴中加温,搅拌,使琼脂完全溶解,趁热用纱布过滤,待溶液冷却到65℃左右时,加入叠氮钠(NaN3),使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上,约3mm厚,待其冷却,完全凝固后,用打孔器打孔(图2-4)。中央孔内加适量抗原(容量为50μl),周围各孔内分别加入50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清,37℃下孵育24h,观察有无沉淀线产生,以判断血清的稀释度。
  2.特异性测定   抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常,特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低,表示抗血清的特异性好,反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线,计算各自的结合率(B/T或B/B0),求出各自在IC50时的浓度,按下列公式计算交叉反应率。
  S=y/Z×100%
  S:交叉反应率,y:IC50时抗原浓度,Z:IC50时近似抗原物质的浓度。
  如某抗原的IC50浓度为90Pg/管,而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大,可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零,即无交叉反应,该抗血清的特异性是好的。
  3.亲合力   在免疫学中, 亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松,结合后会迅速解离,称为亲合力低,反之,亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小,抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔(L/mol)。在RIA中,K是该抗血清能达到的最小检出量(灵敏度)的倒数,K=1/[H],[H]是最小检出量,通常,K的范围在108~1012L/mol之间,也有高达1014L/mol的。
  计算亲合常数的方法20余种,计算出的K都不能真实反映实验情况,只能作为参考。
  (七)免疫失败的可能原因及应采取的措施
  有时不能获得满意的抗血清,可从下列几方面找原因,并改进之。
  (1)免疫动物的种属及品系是否合适,可考虑改变动物的种属或品系,或扩大免疫动物的数量。
  (2)抗原质量是否良好,可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号,也可考虑改变抗原分子的部分结构,或改进提取方法。
  (3)制备的免疫原是否符合要求,可从偶联剂,载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑,并加以改进。
  (4)所用的佐剂是否合适,乳化是否完全,可改用其它佐剂,或加强乳化。
  (5)免疫的方法、剂量,加强免疫的间隔时间和次数,免疫的途径是否合适。
  (6)动物的饲养是否得当,如营养(饲料、饮水)、环境卫生(通风、采光、温度)是否符合要求,动物的健康情况是否良好等。

多克隆抗体技术编辑本段回目录

抗原刺激机体,产生免疫学反应,由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白,这就是免疫球蛋白,这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体,机体内所产生的抗体就是多克隆抗体;除了抗原决定簇的多样性以外,同样一类抗原决定簇,也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
(一)免疫动物
供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类,常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定,也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体,多采用大动物;如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备抗体;如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯系小鼠制备;一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物,雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适,有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异,免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的,而且千差万别。就其化学成分而言,有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言,有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原,如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清,最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低,不能引起足够强的免疫刺激,免疫剂量过多,有可能引起免疫耐受。在一定的范围内,抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言,小鼠的首次免疫剂量为50μg~400μg/次,大鼠为100μg~1 000μg/次,兔为200μg~1 000μg/次。加强计量为首次剂量的1/5~2/5。
免疫剂量与注射途径有关,一般而言,静脉注射剂量大于皮下注射,而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大,也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小,对家兔而言,采用弗氏完全佐剂,则需注射0.5mg~1mg/kg./次,如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清,宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者,可少量多次。免疫周期短者,应大量少次。
两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果,太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般间隔时间应为5~7天,加佐剂者应为2周左右。
注射的Ig纯度高,则一般不易引起过敏反应,如注射血清,即使是少量,在再次免疫时,极易引起过敏反应,所以一定要采取措施。
(二)佐剂的应用
    对可溶性抗原而言,为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的,常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
    1.佐剂的类型  目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。
    ⑴ 弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)
           羊毛脂                1 份
           石蜡油                5 份
    混合,高压灭菌后保存。用时加热融化,冷却至50℃左右,加抗原进行乳化处理。
    ⑵ 弗氏完全佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)
           弗氏不完全佐剂        10ml
           卡介苗                10mg~200mg
    卡介苗可100℃10min灭活处理。
    初次免疫时,最好用弗氏完全佐剂,以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时,一般不用完全佐剂,而采用弗氏不完全佐剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时,一般不用弗氏完全佐剂,以免卡介苗的干扰。
    ⑶ 脂质体:是人工制备的类脂质的小球体,由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成,这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质,他们被包裹在脂质体内部的水相中,或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面,起到明显的免疫增强作用。
    ⑷ 油佐剂 :采用植物油和矿物油均可,包括豆油、花生油、油菜油等。目前应用最广的矿物油。
10号白油(石蜡油)     100ml
硬脂酸铝               2g
司本80                6ml
    混合加热融化,分装。用时按下列配方进行乳化。
            油相                   3份
            水相(加4%吐温-80)  1份
    先把油相搅拌起来,然后缓慢加入水相乳化。司本是油分散剂,吐温是水分散剂,均有利于乳化。
    2.乳化  将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多,可采用研钵乳化;可直接在旋涡振荡器上乳化;可用组织捣碎器乳化。少量时,特别是弗氏佐剂与抗原乳化时,常采用注射器乳化,用两个注射器,一个吸入抗原液,一个吸入佐剂,两注射器头以胶管连接,注意一定扎紧,然后来回抽吸。当大量乳化时,可采用胶体磨进行。
    乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间(在保存期内)出现油水分层也是未乳化好的表现。
    根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
    免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。抗原量少,则一般多采用加佐剂,淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射,如抗原量多,则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。
    注射间隔时间  带佐剂的皮内、皮下注射,一般为间隔2~4周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射,一般为1~2周间隔时间;肌肉或静脉免疫的,可5天左右的间隔时间。
    可以把各种注射途径联合起来应用,最终以达到效价要求为目的。
(三)抗体的鉴定 
    1.抗体的效价鉴定  不管是用于诊断还是用于治疗,制备抗体的目的都是要求较高效价。不同的抗原制备的抗体,要求的效价不一。鉴定效价的方法很多,包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法,以资比较。如制备抗抗体的效价,一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
    2.抗体的特异性鉴定  抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高,它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线,计算各自的结合率,求出各自在IC50时的浓度,并按下列公式计算交叉反应率。如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管,而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时,表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0,即该血清的特异性较好。

    3.抗体的亲和力  是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示,K的单位是L/mol,通常K的范围在108~1010/mol,也有多达1014/mol。抗体亲和力的测定对抗体的筛选,确定抗体的用途,验证抗体的均一性等均有重要意义。
(四)抗血清的冻存
抗血清收获后,加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐,或加入等量的中性甘油,分装小瓶,置-20℃以下的低温保存,数月至数年内抗体效价无明显变化。注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。

Fab片段的制备方法编辑本段回目录

利用胃蛋白酶分解IgG,将抗体断链为Fab和Fc片段。具体操作方法如下:
1.将IgG粉末100mg,溶于2ml0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液。溶液稍成白浊,30℃,保温10min。
2.取结晶胃蛋白酶1.50mg,溶于1.50ml 0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液,加入上述溶液中,于30℃作用16h。
3.用0.10Mol/L pH8.0 PBS透析一夜。
4.加入硫醇使成0.10mol/L,在室温下搅拌30min。
5.加入1Mol/L的碘乙酰胺(Indoacetamide)使成为0.10Mol/L,室温下搅拌1h。
6.用0.01Mol/L PBS 1 000ml透析过夜,3 000r/min,离心30min,去沉淀。
7.以上清过SephadexG100(40cm×2.0cm)以0.10Mol/L PBS洗脱。
8.以每管6ml收集,约在第8管开始,Fab片段被洗脱。
9.测OD280nm,将Fab管合并,浓缩、冻干。
10.如制备F(ab)2,上述4~6步骤则可以省略。

抗Ig抗体的制备编辑本段回目录

(一)抗原制备
Ig是免疫球蛋白,对异种动物而言,是良好的抗原物质。可以刺激异种动物产生抗Ig血清,经适当提取后,产生抗Ig抗体,又叫第二抗体或抗抗体。在多数的间接标记反应中,均需制备抗Ig抗体。
(二)材料与试剂
1.提取的动物Ig
2.弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂
3.青霉素和链霉素
4.实验动物  兔
5.其它材料及试剂
(三)操作方法
1.免疫方法  可以采用以下各种方法之一进行免疫。
(1)淋巴结注射法:①在兔的两后足跖部皮下(或皮内)注射活卡介苗50mg(每侧约0.30ml)。7~10天后,兔跖及腘肌淋巴结肿大;②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml);③必要时,14天后,重复步骤②一次;④再过7天后,于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml);⑤5~7天后,耳静脉采血。测定血清效价。
(2)皮下多点注射法:①家兔两侧掌(跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml(IgG含量5mg/ml);②7~10天后,脊柱两侧多点(颈、胸、腰椎各两点、共6点)皮下注射含不完全佐剂的抗原,每点0.50ml;③7~10天后,脊柱两侧重复注射一次;④7~10天后试血。不合格者重复步骤③。
(3)多途径联合注射法:①两侧掌(跖)内侧皮下注射含完全佐剂抗原0.50ml(IgG量为5mg/ml);②14天后,多点皮下注射含有不完全佐剂抗原;③7天后,耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml;④测定血清抗体效价,不合格者重复步骤③,并适当递增IgG量。
2.效价测定  采用琼脂扩散法。
⑴ 将血清倍比稀释,加入外周孔。
⑵ 中间孔加动物Ig。
⑶ 37℃湿盒琼扩24小时,观察结果。
(四)结果判定
1.抗Ig的效价测定  琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。
2.纯度鉴定  采用琼扩法。中间孔加抗Ig血清,外周孔加Ig和标准品Ig。在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线,且这两条沉淀线相互融合者,说明提取的Ig是纯的。

禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法)编辑本段回目录

1.试剂
⑴ 5%葡聚糖硫酸盐
⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
⑶ 无水硫酸钠
⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液
⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
2.操作方法
⑴ 取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。
⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g,缓慢加入,混匀,静置30min,3 000r/min离心去上清。
⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g/ml,同上法离心去上清。
⑷ 重复步骤⑶,加Na2SO4,使成0.14g/ml。
⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐48h。
⑹ 过SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。
⑺ 如要进一步提纯,则用第二峰再过DEAE—纤维素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为IgG。
也可以按以下操作方法进行:
⑴ 以18%硫酸钠(W/V)提取一次,再以14%的硫酸钠提取一次。
⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入无水硫酸钠,离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中4℃透析,直至无SO42-为止。
⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
⑷ 过SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡IgG。

禽IgA提取与纯化编辑本段回目录

(一)材料与试剂配制
1.禽胆汁
2.饱和硫酸铵溶液
3.0.01Mol/L pH7.4PBS液
4.0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
5. DEAE52-纤维素
(二)操作方法
1.取冷藏的胆汁3Ⅹml,缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
2. 3 000r/min离心30min,去沉淀。
3. 取上清,加饱和硫酸铵液,使成35%的饱和度,4℃放置30min。
4. 3 000r/min离心30min,弃上清。
5. 取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加饱和硫酸铵溶液,重复步骤3和4三次。
6. 将沉淀用0.85%NaCl液溶解,装入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7. 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,过DEAE52纤维柱(20×250mm)。
8. 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
9. 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl浓度为0.30Mol/L)洗脱,收集洗脱液。
10.浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml,分装,低温冰箱保存。

猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联血清的制备编辑本段回目录

(一)材料及试剂
 1.猪瘟疫苗
2.猪丹毒菌苗
3.猪肺疫疫苗
4.肥猪
(二)操作方法
    1.基础免疫  选健康的育肥猪数头,进行猪瘟、猪丹毒和猪肺疫三种疫苗的基础免疫。猪瘟疫苗采取肌肉注射法,猪丹毒和猪肺疫采用口服法进行。
    2.加强免疫  基础免疫后7~10天,进行加强免疫。猪瘟疫苗、猪丹毒和猪肺疫菌苗分别为200头份、100头份和100头份,肌肉或皮下注射。
3.7天后,进行第二次强化注射,剂量同前。
4.10~12天后,无菌放血和收集血液。放血前一天晚上停食,可饮水。
5.血液自然凝固、分离血清。按0.3%加石炭酸,无菌分装,冰箱内保存。
(三)结果判定
1.物理性状检查  血清清亮、透明,呈草黄色或金黄色。
2.无菌检查  采血清样进行普通肉汤、琼脂斜面、肝片肉汤,观察3~7天,应无菌生长。
3.安全检查  取血清样0.50ml,皮下注射小白鼠,一次注射3~5只,观察7天,小白鼠应健康存活。
4.效力检查  猪丹毒和猪肺疫的小白鼠攻毒试验,保护率应为100%。

鸡新城疫和鸡传染性法氏囊炎二联高免卵黄抗体的制备编辑本段回目录

(一)材料与试剂
1.新城疫灭活油佐剂苗
2.患传染性法氏囊炎的法氏囊组织
3.传染性法氏囊炎弱毒苗
4.健康产卵鸡群
5.新城疫血凝抗原
6.传染性法氏囊炎琼扩抗原
7.其它
(二)操作方法
1.传染性法氏囊炎组织灭活苗的制备  将有病变的法氏囊组织称重,以组织捣碎器捣成匀浆,按1︰5(重量︰体积)加灭菌生理盐水,继续捣匀,然后用5层灭菌纱布过滤,加入0.30%的甲醛,混匀,37℃感作24h,中间振荡数次。灭活后,以常规培养基进行杂菌检查,以小白鼠进行安全检查,合格后,置阴凉处备用。
2.传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗的制备  将10号白油按2%加硬脂酸铝粉和6%的司本-80混合加热融化后,分装保存。灭活组织液以4%比例加入吐温80,以油相︰水相=3︰1的剂量制成灭活油佐剂组织苗。先将油相搅拌起来,逐渐加入水相,充分搅拌即可。
3.选取健康无主要传染病,特别是无鸡白痢、沙门氏菌病的高产鸡群。
4.将鸡新城疫灭活油佐剂苗与传染性法氏囊炎灭活油佐剂组织苗等量混合,给每只鸡皮下注射2ml。
5.14天后,从鸡翅静脉采血,采集血清做鸡新城疫血凝抑制试验和传染性法氏囊琼脂扩散试验。血凝抑制价平均达到1︰2084,琼扩效价达到1︰16以上,即为合格。如不合格,可继续重复步骤4。
6.效价合格,收获鸡蛋。
7.将鸡蛋水洗后,浸入0.50%石炭酸水中消毒半小时,捞出后,置无菌室紫外线照射20min。无菌操作去蛋皮,收取卵黄,按1︰1加入灭菌的含1%石炭酸生理盐水,搅拌,以两层纱布过滤,滤液即为鸡新城疫和传染性法氏囊炎二联高免卵黄抗体。
8.4℃~8℃保存备用。
(三)结果判定
1.物理性状  呈均一的橙黄色带胶状的液体,放置一定时间,下沉多量的黄白色絮状沉淀,摇匀后,仍呈均一黄色或淡白色液体。
2.效价  新城疫血凝抑制价应大于1024×,传染性法氏囊炎琼扩效价应大于8×。
3.安全检查  取3ml~5ml卵黄液一次皮下注射小白鼠或雏鸡,无任何影响。
4.杂菌检查  应无菌生长。
5.效力检查  对典型的新城疫病鸡和传染性法氏囊炎病鸡,肌肉或皮下注射1ml,3天内应有80%以上明显好转或痊愈。

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