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中药化学实验技术

标签: 中药化学 提取 分离 结晶 层析

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中药化学是一门结合中医药基本理论,运用现代科学技术, 特别是运用化学及物理学的理论和方法研究中药化学成分的学科。是一门中药与化学相结合、传统与现代科学相结合的知识和技术。

目录

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经典的提取和分离方法编辑本段回目录

(一)溶剂法
1.基本概念
    有机化合物分子中,有的亲水性基团多,极性大而疏于油;有的亲水性基团少,极性小而疏于水,这种亲水性和亲脂性的程度大小与化合物的分子结构直接相关。一般来说,两种基本母核相同的成分,其分子中官能团的极性越大或极性官能团数量越多,则整个分子的极性就越大,表现亲水性强,而亲脂性就越弱;其分子非极性部分越大或碳链越长,则极性小,亲脂性强,而亲水性就越弱。  
    各类溶剂的性质,同样与其分子结构有关。常用的甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂,它们的分子比较小,并存在羟基与水分子的结构近似,可和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽亦都有羟基,但分子中的碳键逐渐加多,与水性质也就逐渐疏远,所以它们彼此仅能部分互溶,在它们互溶达到饱和状态后,两者都能与水分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物,属于亲脂性强的溶剂。
    常见溶剂的极性度强弱顺序可表示如下:
    石油醚(低沸点一一高沸点)〈二硫化碳〈四氯化碳〈三氯乙烷〈苯〈二氯甲烷〈氯仿〈乙醚〈乙酸乙酯〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈乙睛〈水〈吡啶〈乙酸。   
通常按极性化合物易溶于极性溶剂,非极性化合物易溶于非极性溶剂,同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择,溶剂选择适当,就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。一般对溶剂的要求是:(1)溶剂对所需成分的溶解度要大,对杂质溶解度要小,或反之。(2)溶剂不能与中药成分产生化学反应,即使反应亦属于可逆性的。(3)溶剂要经济易得,并具有一定的安全性。(4)沸点宜适中,便于回收反复使用。
2.提取方法
    用溶剂提取中药成分时,常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时,原料的粉碎度、提取时间、温度以及设备条件等因素也都能影响提取效率,必须加以考虑,所用容器一般为玻璃或搪瓷器皿。   
(二)水蒸气蒸馏法
    此法适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中药成分的提取。这些化合物与水不相混溶或仅微溶,且在约100℃时有一定的蒸汽压。当水蒸气加热沸腾时,能将该物质—并随水蒸气带出。如中药中的挥发油,某些小分子生物碱,如麻黄碱、槟榔碱等,以及某些小分子的酸性物质,如丹皮酚等均可应用本法提取。对一些在水中溶解度较大的挥发性成分可采用蒸馏液重新蒸馏的办法,收集最先馏出部分,使挥发油分层,或用盐析法将蒸馏液中挥发性成分用低沸点非极性溶剂如石油醚、乙醚抽提出来。
(三)分馏法
    利用沸点不同进行分馏,然后精制纯化,在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱以及石榴皮中的伪石榴皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱时均可利用它们的沸点不同进行常压或减压分馏,然后再精制纯化。
(四)吸附法   
    吸附法的目的,一种是吸附除去杂质,这常指鞣质、色素;另一种是吸附所需物质。常用的吸附剂有氧化铝、氧化镁、酸性白土和活性炭等。如京尼平苷的分离,取栀子粉,用乙醇提取,提取物的水溶液加氧化镁吸附,然后用乙酸乙酯洗脱,洗脱液浓缩得黄色固体粉末,再经乙酸乙酯/丙酮(1:1)重结晶即得到京尼平苷的纯品。
(五)沉淀法
    利用某些中药成分与某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”的方法。但对所需成分来讲,这种沉淀反应是可逆性的。最常用的是铅盐法,利用中性乙酸铅或碱式乙酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐沉淀,故可利用这种性质使所需成分与杂质分离,脱铅方法常通以硫化氢气体,使其分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。但溶液中可能有多余的硫化氢存在,可通入空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体。若对热稳定的化合物,可将溶液置于蒸发皿内,水浴上加热,浓缩除去。脱铅的方法也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等,但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度,所以脱铅不彻底。但由于方法比较简便,故实验室中仍常采用。
此外,还有乙酸钾、氢氧化钡、磷钨酸、矽钨酸等沉淀剂。对多糖、蛋白质等常用丙酮、乙醇或乙醚沉淀。
(六)盐析法
    盐析法通常是向中药水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态,使某些成分在水中的溶解度降低,沉淀析出或被有机溶剂提取出。常用的无机盐有氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等。如三颗针根粉用稀酸浸泡,稀酸液加氯化钠近饱和即析出小檗碱盐酸盐。
(七)透析法  
    利用小分子物质在溶液中可透过半透膜,而大分子不能透过半透膜的性质而达到分离的方法。常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。透析法可除去其中无机盐、单糖、双糖等。透析是否成功与膜孔的大小密切相关,根据欲分离成分分子的大小选择适当规格的透析膜。常用的有动物膜(如猪、牛的膀胱),火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。在进行透析时应经常更换膜外清水,增加透析膜内外溶液的浓度差,必要时可适当加温并加以搅拌,以加快透析速度。   
(八)升华法
    固体物质加热时,直接变成气态,遇冷凝结成原来的固体,此现象称为升华。中药中凡具有升华性质的化合物,均可用此法进行纯化。例如樟木中的樟脑,茶叶中的咖啡因以及存在中药中的苯甲酸等成分。升华法简单易行,但往往不完全,常伴有分解现象,产率低,操作时采用减压下加热升华则可避免,但该法很少用于大规模制备。 

结晶和重结晶编辑本段回目录

    结晶的目的在于进一步分离纯化,便于进行化学鉴定及结构测定工作。中药成分中大半是固体化合物,且具有结晶的通性,可以根据其溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。一般能结晶的化台物可望得到单纯晶体,纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征,这有利于化合物性质的判断,所以结晶是研究分子结构的重要步骤。   
    由于初析出的结晶多少总会带有一些杂质,因此需要通过反复结晶才能得到纯粹的单一晶体,此步骤称为复结晶或重结晶。有时中药中某一成分含量特别高,找到合适的溶剂进行提取,提取液放冷或稍浓缩,便可得到结晶。   
(一)结晶的条件   
需要结晶的溶液,往往呈过饱和状态。通常是在加热的情况下,使化合物溶解,过滤除去不溶解杂质,然后浓缩、放冷,析晶。最合适的温度为5~10℃左右。如果在室温条件下可以析晶,就不一定要放入冰箱中。放置对形成结晶来说是一个重要条件,它可使溶剂自然挥发到适当的浓度,即可析出结晶。特别是在探索过程中,对未知成分的结晶浓度是很难预测的,有时溶液太浓,粘度大就不易结晶;如果浓度适中,逐渐降温,可能析出纯度较高的结晶。X-射线衍射用的单晶即采用此法。在结晶过程中溶液浓度高则析出结晶的速度快,颗粒较小,夹杂的杂质可能多些。有时自溶液中析出结晶的速度太快,超过化合物晶核的形成和分子定向排列的速度,往往只能得到无定形粉末。
(二)结晶溶剂的选择
    选择合适的溶剂是形成结晶的关键。最好它能对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差异,同时不产生化学反应,即热时溶解,冷时则析出。对杂质来说,在该溶剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶,则可用洗涤法除去杂质后再用合适溶剂结晶。   
    要找到合适的溶剂,一方面可查阅有关资料及参阅同类型化合物的结晶条件;另一方面也可进行少量探索,参考“相似相容原理”加以考虑。常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂,要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小,这样在放置时,沸点低的溶剂较易挥发,而比例逐渐减少易达到过饱和状态,有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高,要适中,约在60℃左右,沸点太低溶剂损耗大,亦难以控制;太高则不便浓缩,同时不易除去。
    在结晶或重结晶时要注意化合物是否和溶剂生成加成物或含有结晶溶剂的化合物。但有时也利用此性质使本来不易形成结晶的化合物得到结晶。
(三)制备结晶的方法   
    结晶形成过程包括晶核的形成与晶体的增长两步骤。因此,选择适当的溶剂是形成晶核的关键。通常将化合物溶于适当溶剂中,过滤、浓缩至适当体积后,塞紧瓶塞,静置,如果放置一段时间后没有结晶析出,可松动瓶塞,使溶剂自动挥发,可望得到结晶;或可加入少量晶种,加晶种是诱导晶核形成的有效手段。一般地说,结晶化过程具有高度的选择性,当加入同种分子,结晶便会立即增长。如没有晶种时,可用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁,产生微小颗粒代替晶核,以诱导方式使形成结晶。有时用玻璃捧蘸取过饱和液在空气中挥发除去部分溶剂后再摩擦玻璃器壁。上述条件失败后,应考虑所用物质纯度不够,可能是由于杂质的影响所致,则需进一步分离纯化,再尝试结晶,或化合物本身就是不能形成晶体的化合物,如菸碱等。   
(四)不易结晶或非晶体化合物的处理
化合物不易结晶,其原因一种是本身的性质所决定,另一种在很大程度上是由于纯度不够,夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化,若是本身的性质,往往需要制备结晶性的衍生物或盐,然后用化学方法处理,回复到原来的化合物,达到分离纯化的目的。
    如生物碱,常通过成盐来达到纯化,常用的有盐酸盐,氢溴酸盐、氢碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。如粉末状莲心碱是通过过氯酸盐结晶而纯化的;治疗肝炎药物的有效成分垂盆草苷,本身是不结晶的,其乙酰化物却具有良好的针状晶体。此外,也可利用某些化合物与某种溶剂形成复合物或加成物而结晶,如穿心莲亚硫酸氢钠加成物在稀丙酮中容易结晶;蝙蝠葛碱能和氯仿或乙醚形成加成物结晶。但有些结晶性化合物在用不同溶剂结晶时亦可形成溶剂加成物,如汉防己乙素能和丙酮形成结晶的加成物;千金藤素能与苯形成加成物结晶。
    结晶的形状很多,常见为针状、柱状、棱柱状、板状、方晶、粒状、簇状及多边形棱柱状晶体等,结晶形状随结晶的条件不同而异。
(五)结晶纯度的判断
    每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点,可以作为初步鉴定的依据,并结合薄层色谱或纸色谱,经三种以上不同展开系统展层,均显示的单一斑点来判断结晶的纯度。而非结晶物质则不具备上述物理性质。纯结晶性化合物都有一定的晶形和均匀的色泽,通常在同一种溶剂下结晶形状是一致的,单纯化合物晶体的熔点熔距应在0.5℃左右,但由于晶体结构的原因可允许在1—2℃内。但也有例外,特别有些化合物仅有分解点,而熔点不明显。对立体异构体和结构非常类似的混合物,如土槿皮酸从晶形、熔点、熔距来看,是纯化合物的特征,但薄层检查有三个斑点。

层析分离方法编辑本段回目录

    层析法是目前一种被广泛应用的分离纯化的方法。由于中药中的各类成分结构不同,性质各异,选择的层析法也是不同的。
    层析法的分类有两种:一种是根据两相所处的状态来划分,当液体作为流动相时称液相层析,气体作为流动相时称气相层析。另一种是根据层析过程的机理来分类,利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异来分离的称吸附层析;利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离的称分配层析;利用分子大小不同进行分离的称排阻层析或分子筛层析;利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离的称离子交换层析等等。
    需要提出的是,在层析过程中并非是单因素的作用,而是多因素的作用来达到分离目的的。下面介绍实验室中常用的一些层析方法。   
(一)硅胶柱层析   
硅胶为一多孔性物质,可用通式SiO2•xH2O表示。它具有多孔性的硅氧环的交键结构,由于其骨架表面具有很多游离、键合的硅醇基基团,它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用,同时能吸附多量的水分。当加热活化(100~110℃)时,硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去。但温度升至500℃时,硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键而不再具有吸附的性质。  
硅胶层析适用范围广,适用于非极性和极性化合物,如萜类、甾体、生物碱、强心苷、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类,脂肪酸、氨基酸等的分离。   

1.层析柱的制备
    硅胶装柱一般用湿法,即将硅胶混悬于装柱溶剂中,不断搅拌,待溶液中气泡除去后,连同溶剂一起倾入层析柱中,层析柱中硅胶段直径与长度之比为1:20~1:30。若硅胶的颗粒较细,而粒度分布范围窄,则可采用短柱(1:5),这样不仅增大了截面积,而且也增加了样品的载量。硅胶最好一次倾入,否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一,使硅胶柱有明显的分段现象,影响分离效果。另亦可采用干法装柱,将所需硅胶一次倾入柱中,然后墩紧至硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1:30~1:60。   
2.加样
    样品上柱可采取二种方式,如样品能溶于流动相,可用少量流动相溶解,从柱顶加入;如样品难溶于流动相,则可溶于适当的溶剂,拌于干燥硅胶上,待溶剂挥发尽后,再上柱。最后,在柱顶覆盖一薄层层析用硅胶或棉花,然后用流动相洗脱。
3.洗脱
    层析过程中溶剂的选择,对组分分离关系极大,一般没有可循的规律。通常是根据物质的极性采用相应的极性溶剂来洗脱。溶剂的洗脱能力随介电常数增大而增大,在实际吸附层析中是采用逐步递增极性的梯度洗脱方式。通常,借助硅胶薄层层析的结果来摸索分离条件,基本上可以套用于柱层析。两者所不同的在于样品与硅胶的用量比例,故通常柱层析所用的溶剂比薄层层析展开剂极性略偏小。再者可参阅前人分离同类型物质时所用的溶剂系统条件。
(二)氧化铝层析   
氧化铝层析是常用的层析方法,适用于亲脂性成分分离。广泛应用于生物碱、甾体化合物、强心苷、精油、内酯化合物等中药成分的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、活性容易控制而能适应不同化合物层析要求等优点。但是氧化铝层析还有许多缺点,有部分酚性化合物(如黄酮类化合物)、部分酸性物质(如三萜酸)能与氧化铝结合而不能应用。   
影响氧化铝层析的因素很多,实际操作时主要是选择具有适当活性和适当酸碱度的氧化铝,以及能充分发挥其分离效能的溶剂。

1.氧化铝层析柱的选择
    层析柱的装置,其内径与柱长的比例在1:10—1:20之间。有时由于特殊需要,例如两个或两个以上性质相近的成分的分离,为了提高分离效果,可适当采用细长的层析柱。   
2.层析柱的制备   
    一般先量取一定体积的溶剂(V0),将层析柱的活塞稍打开,使溶剂滴入接收器中,同时将氧化铝慢慢地加入使它一面沉降,一面添加,直到加完为止。氧化铝加入速度不宜太快,否则将带入气泡而“破坏”层析柱。必要时可在层析管外轻轻给以振动,使氧化铝均匀下降,并有助于氧化铝带入的气泡外溢。当采用活性较高的氧化铝进行层析时,更应注意。待氧化铝加完后,仍使溶剂流动一定时间,然后将氧化铝柱上面的溶剂全部滴入接收器,量取接收器内溶剂量(V1)。从V0—V1之差,称为柱体积。这样,在层析过程中,我们就能主动掌握大致在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时候,就新换溶剂大致从何流份开始。
    氧化铝的用量一般采用样品量的20~50倍,根据被分离化合物的性质而定。有时遇到碳氢化合物如萜烯、倍半萜烯等,氧化铝对这些化合物的吸附力较弱,层析时氧化铝用量略增,为样品量的100~200倍,而且为了尽量减少碳氢化合物在层析柱中扩散,层析过程中不能有间歇。
3.加样
    一般将样品溶于有机溶剂中,轻轻注入已准备好的氧化铝柱上面,勿使氧化铝柱面受到扰动,否则将影响层析效果。如果样品不易溶于开始层析时使用的有机溶剂,那么,先将样品溶于能溶的有机溶剂,以少量的氧化铝拌匀,然后将有机溶剂挥发干挣,再按氧化铝一般装柱法,将带有样品的氧化铝加入层析柱中。
4.洗脱   
    洗脱过程与氧化铝活性、被吸附物质的性质、温度及溶剂的性质及浓度有关。就溶剂而言,极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大,所以逐步增加溶剂的极性,可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物逐个洗脱,达到分离的目的。
(三)聚酰胺层析
聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质,商品名为锦纶、尼龙。自1955年发现聚酰胺层析分离酚性物质以来,目前已发展成为分离极性和非极性物质的用途广泛的层析方法,如黄酮类、酚类、醌类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、苷类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等。尤其是对黄酮类、酚类、醌类等物质的分离,远比其他方法优越。其特点是:对黄酮类等物质的层析是可逆的,分离效果高,可使性质极相近的类似物得到分离;其柱层析的样品容量大,适于制备分离。聚酰胺薄膜层析则是一种用途广、快速、简便的分析、分离方法。因此,聚酰胺层析应用后,不仅为黄酮等酚性物质的分离提供了有效方法,而且也为分离其他物质增加了一种手段。

1.聚酰胺粉的处理
    锦纶中通常有两种杂质:一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物。另一种是蜡质(锦纶丝在制成后,表面曾涂过一层蜡)。这些杂质必须除去,否则原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物。蜡质能被醇液洗脱下来,与分离物质混在一起则难以除去。除去单体及小分子聚合物的方法,具体如下:聚酰胺粉以90~95%乙醇浸泡,不断搅拌,除去气泡后装入层析柱中。用3~4倍体积的90~95%乙醇洗涤,洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用2~2.5倍体积的5%氢氧化钠水溶液、1倍体积的蒸馏水、2~2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗涤,最后用蒸馏水洗至中性,备用。
2.层析柱的制备
    若用含水溶剂系统层析,常以水装柱。在以非极性溶剂系统层析时,常以溶剂组份中极性低的组份装柱。若以氯仿装柱,因其比重较大,使聚酰胺粉浮在上面,加样时应将柱底端的氯仿层放出,并立即加样,加样后顶端以棉花塞紧,在层析关闭时,应将顶端的多余氯仿液放出,否则,聚酰胺会浮起而搅乱层析带。
3.加样
    聚酰胺的样品容量较大,一般每100 ml聚酰胺粉可上样1.5~2.5g,可根据具体情况适当增加或减少。若利用聚酰胺除去鞣质,样品上柱量可大大增加,通常观察鞣质在柱上形成的橙红色色带的移动,当样品加至该色带移至柱的近底端时,停止加样。样品常用洗脱剂溶解,浓度在20~30%。不溶样品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易挥发溶剂溶解,拌入聚酰胺干粉中,拌匀后将溶剂减压蒸去,以洗脱剂浸泡装入柱中。   
4.洗脱
聚酰胺层析的洗脱剂常采用水-乙醇(10%、30%、50%、70%、95%),氯仿-甲醇(19:1,10:1,5:1,2:1,1:1)依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来,可采用3.5%氨水洗脱。洗脱剂的更换,一般根据流出液的颜色,当颜色变为很淡时更换下一种溶剂,并以适当体积分瓶收集,分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其成分,成分相同者合并。再进入下一步纯化。
(四)活性炭层析
活性炭柱层析对于分离水溶性物质(如氨基酸、糖类及某些苷类)是一种较好的方法,它是分离水溶性物质的主要方法之一。其特点是样品上柱量大,分离效果好,活性炭来源较易,价格便宜,适用于大量制备分离。但是,由于活性炭的生产原料不同,制备方法及规格不一,其吸附力不象氧化铝、硅胶那样易于控制。到目前为止,尚无测定其吸附力级别的理想方法,因而限制了其广泛应用。

1.活性炭的来源、规格及性能
    活性炭的来源一般分为动物炭、植物炭和矿物(煤)炭三种,分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。目前市售的医药用活性炭及层析用活性炭多以木屑做原料,加氯化锌在700~800℃高温炭化、活化,经适当处理除去杂质而制成。由于植物体内含有各种金属离子及生产过程中加入氯化锌,虽在出厂前经过适当处理,但也难免含有微量重金属离子,用时应注意。
    用于层析的活性炭,基本上可以分三类:
  (1)粉末状活性炭:一般为医药用或化学纯活性炭。该类活性炭颗粒极细,呈粉末状,其总表面积特别大,吸附力及吸附量也特别大,是活性炭中吸附力最强的一类。但是,由于其颗粒太细,在层析过程中流速极慢,需要加压或减压操作,手续较繁。
  (2)颗粒状活性炭:其颗粒较前者为大,其总表面积也相应减小,吸附力及吸附量也较次于前者。但是,在层析过程中流速易于控制,勿需加压或减压操作,克服了粉末状活性炭的缺点。   
  (3)锦纶活性炭:这种活性炭是以锦纶为粘合剂,将粉末状活性炭制成颗粒。其总表面积较颗粒状活性炭为大,较粉末状活性炭为小,其吸附力较二者皆弱。因为锦纶不仅单纯起一种粘合作用,它也是一种活性炭的脱活性剂,因此可用于分离前两种活性炭吸附太强而不易洗脱的化合物。用其分离酸性氨基酸及碱性氨基酸,可取得很好效果。流速易控制,操作简便。
2.活性炭对物质的吸附规律及应用   
活性炭在水溶液中的吸附力最强,在有机溶剂中吸附力较弱,故用有机溶剂脱吸附。在一定条件下,对不同物质的吸附力也不一样,一般来讲:
  (1)对极性基团(如-COOH,-NH2,-OH等)多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。例如,活性炭对酸性氨基酸和碱性氨基酸的吸附力大于中性氨基酸。原因就是酸性氨基酸中的羧基比中性氨基酸多,碱性氨基酸中的氨基(或其他碱性基团)比中性氨基酸多。因而,可借此性质将酸性氨基酸或碱性氨基酸与中性氨基酸分开。
  (2)对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,因而可借此性质将芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸(两者的氨基和羧基数目相同)分开。也可将某些水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。
  (3)对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如,活性炭对肽的吸附力大于氨基酸,对多糖的吸附力大于单糖。因此可利用活性炭分离氨基酸与肽,单糖与多糖。氨基酸、单糖先洗脱下来;肽、多糖后洗脱下来。
3.活性炭的处理
    活性炭是一种强吸附剂,对气体的吸附力及吸附量都很大。气体分子占据了活性炭的吸附表面,因而造成所谓活性炭“中毒”,使其活力降低。同时,又有一些气体可引起某些副反应,如氧气可引起层析物质的氧化。为了防止该副反应的发生,最简单方便的方法就是加热烘干,可将吸附的绝大多数气体除去。一般在使用前,将活性炭在120℃加热干燥4~5小时即可。锦纶活性炭因锦纶受热温度高要变形,在100℃干燥4~5小时即可。
    另外,活性炭在生产过程中曾加入氯化锌活化,生产原料木屑内也含有各种金属离子,它们对层析带来很多麻烦。特别是重金属离子,其本身具有很高的毒性,而且吸附在活性炭表面上,具有强的催化作用,致使层析物质产生某些催化反应,因此必须将其除去。医药用、化学纯活性炭在出厂前对所含杂质及重金属均经检查,符合规定要求。锦纶活性炭在制备过程中也经过大量酸洗、水洗,勿需特别处理即可应用。但是,工业用活性炭在用前必须进行严格处理,一般处理方法有二:
   一、将工业用活性炭置于烧瓶中,加入2~3M盐酸,水浴加热半小时,在加热过程中,间歇地振摇。然后减压滤干,如此以酸处理2至3次,再以热蒸馏水洗涤至pH5-6,滤干,烘箱中150℃干燥8小时,置于瓶中,密塞备用。   
   二、将工业用活性炭置于三角瓶中,加20%醋酸水溶液,煮沸5~10分钟,减压滤干,以除去含氮杂质及部分金属离子。如此处理2至3次,再以热蒸馏水洗至pH5-6,滤干。将其悬浮于水中,每100g活性炭中加入氰化钾50mg(预防重金属离子的催化作用),直火加热,在60℃保持10分钟,趁热过滤,以热蒸馏水洗至pH6~7,烘箱中100℃干燥至恒重,于瓶中密塞备用。
4.柱层析的操作  
  (1)装柱:因活性炭在水中吸附力最强,一般在水中装柱。活性炭以蒸馏水浸泡1小时左右,不断搅拌除去气泡。倒入柱中,让其自然沉降,装至所需体积,备用。粉末状活性炭因流速太慢,则需与硅藻土(1:1)混合后,再用蒸馏水调成糊状装柱,并且待样品上柱后,层析柱顶端连有自动控制的加压泵进行层析。   
  (2)加样:样品一般用水溶解。浓度在25~50%之间,即1 g样品溶于2~4 ml水中。活性炭层析的样品上柱量较大,一般每100 mg活性炭可上样5~10 g。在某些情况下,样品的上柱量及样品浓度可适当增加或减少。例如,当欲分离之成分在样品中的相对含量较低,且易吸附于柱上,而其他成分不易吸附时,则可将上柱量增大,使大部分成分很快从柱上流下,而欲分离之成分经适当洗脱即可得到;当欲分离之成分不易被活性炭吸附且不易吸附之成分不只一个,则样品上柱量必须大大减少,才能达到分离目的。总之,具体情况具体分析,不能生搬硬套。某些样品在水中不易溶解时,可加适量甲醇、乙醇或丙酮使其溶解。但样品体积不可太大,样品上柱量也应相应减少,否则影响分离效果。
  (3)洗脱:洗脱溶剂一般采用水、各种浓度的乙醇液。也有人采用5~10%丙酮液、2~5%醋酸、1~5%苯酚水溶液等洗脱,但不常用。最常用的是水-乙醇溶液梯度洗脱,其洗脱顺序是:水、10%、20%、30%、50%、70%的乙醇溶液。若仍有部分物质未洗脱下来,最后可用适当有机溶剂或3.5%氨水洗脱。流出液以适当体积分瓶收集,分别浓缩。用过的活性炭可以用酸碱处理回收,因活性炭来源较易,价格便宜,一般不回收使用。
(五)大孔吸附树脂层析
大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂,也是—种亲脂性物质。它可有效地吸附具有不同化学性质的各种类型的化合物,以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物。大孔吸附树脂由于具有选择性好、吸附容量大、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快、解吸容易等优点,现广泛应用于工业废水的处理,维生素、抗生素的分离提纯及水溶性成分的分离纯化,近年来多用于皂苷及其它苷类化合物的分离。

1.大孔吸附树脂的类型及性能
大孔吸附树脂—般为白色颗粒状,理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶剂。按性能分为极性、中极性和非极性三种类型。非极性吸附树脂是以苯乙烯为单位,二乙烯苯为交联剂聚合而成,故称为芳香族吸附剂。中极性吸附树脂是以甲基丙烯酸酯为单位和交联剂聚合而成,也称为脂肪族吸附剂。极性吸附树脂则在结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。由于树脂性质各异,使用时须加以选择。如分离极性较大的化合物应选用中极性的树脂,而极性较小的化合物则选用非极性树脂。
2.大孔吸附树脂的预处理及再生
    新购的树脂一般是用氯化钠及硫酸钠处理过的,同时树脂内部尚存在未聚合的单体,残余的致孔剂、引发剂、分散剂等,故用前必须除去。将新购的树脂放在烧杯中,加入足量的水,使其溶胀至体积不再增加为止,然后倒入层析柱内,使柱内树脂量不要超过柱长的1/2以上,除去悬浮于水溶液面上的树脂颗粒,再用95%乙醇洗柱,直至流出液加2倍水混合后不呈白色浑浊为止,最后用水洗涤除尽乙醇备用。
    树脂经解吸附后即需再生。再生时用甲醇或乙醇浸泡洗涤即可达到,必要时可用1M盐酸或氢氧化钠溶液依次洗涤,然后用水洗至中性,浸泡在甲醇或乙醇中备用,使用前用水洗涤除尽醇即可使用。
3.柱层析
大孔吸附树脂采用湿法装柱,湿法上样。样品液一般为浓缩液,以澄清为好。混合组分在大孔树脂上吸附后,—般依次用水、含水甲醇、乙醇或丙酮10%,20%……(V/V)洗脱,最后用浓醇或丙酮洗脱,分别收集各部分洗脱液,经TLC或PC检测并合并相同组分。

延胡索生物碱的系统分离法编辑本段回目录

实验目的
(1)了解生物碱的系统分离法的原理及应用。
(2)掌握生物碱的系统分离法的具体操作步骤。
    延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎。主产于河北、山东、江苏、浙江等地。延胡索具有活血、利气、止痛的作用,用于治疗胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后淤阻、跌打疼痛等。主要的化学成分是生物碱,其中叔胺类含量为0.65%,季胺类约0.3%,目前已从中分离得到近20种生物碱。
1.基本原理
    除水溶性生物碱外,大多数生物碱溶于有机溶剂不溶于水,而生物碱的盐类能溶于乙醇及水,难溶于有机溶剂。因此,生物碱盐的水溶液用醚萃取时,生物碱盐不能自水液中提出,必须加碱碱化使生物碱游离,游离的生物碱则可溶于有机溶剂而被提出。常用的生物碱萃取溶剂为乙醚、氯仿。
    生物碱因其结构可分为四种类型,由于生物碱的理化性质与其结构有关,根据其理化性质不同,可将各类型生物碱进行分离(见系统分离流程)。
(1)弱碱性生物碱—一因其碱性极弱,与酸结合成盐不稳固,则易自中性或酸性水溶液中转溶于有机溶剂,故在醚液A中可能出现。
(2)非酚性叔胺生物碱—一一般碱性较强,其盐类在碱化后,生物碱游离,转溶于有机溶剂,故在醚液B中出现。
(3) 酚性叔胺生物碱——可与苛性碱(NaOH,KOH或Ca(OH)2)生成钠、钾或钙盐,溶于水而不溶于有机溶剂,酸化中和后再加碱(氨水或碳酸钠)则游离出生物碱,从而可溶于有机溶剂,故在醚液C中出现。 
(4)水溶性生物碱易溶于水,不溶于有机溶剂。它包括季铵生物碱、氮氧化物等,故保留在最后水溶液中。

2.系统分离流程

中药化学实验技术-层析分离方法

3.操作
    药材选用罂粟科紫堇属植物延胡索(又名元胡、玄胡)Corydalis yanhusuo W.T.Wang块茎粉末。   
(1)预试:按“中药化学成分鉴别法中生物碱的鉴别”项下的实验方法进行,结果填入表中。
(2)生物碱的系统分离及鉴定:取延胡索粉末10 g,加95%乙醇15 ml,水浴回流30分钟,将提取液转于圆底烧瓶中。药渣如前法再提取一次,回流10分钟,合并提取液,用旋转蒸发仪浓缩至无醇味。用5%盐酸30 ml搅拌溶解,冷却后过滤,得澄明水液。残渣用5%盐酸15 ml,同前再操作一次,水液合并。
  ①弱碱性生物碱的分离:用乙醚8 ml萃取前面所得酸水液,并按以下操作步骤检查:取醚层4 ml,再以稀酸水萃取,取酸水层分别与四种生物碱沉淀试剂作沉淀反应,然后根据沉淀产生与否决定是否再萃取,直至沉淀反应阴性为止,得醚液(A)。
  ②非酚性叔胺生物碱的分离:取水液(A)2 ml,分为四份,作沉淀反应,若产生明显沉淀,则将其余水液(A)用2 M NaOH调至pH≧10,用8 ml乙醚萃取,同上法操作。得醚液(B)。
  ③酚性叔胺生物碱的分离:取水液(B)2 ml酸化至pH<3,分为四份作沉淀反应,若产生明显沉淀,向水液(B)中加2%盐酸中和,再用5%氨水调至pH9左右,同上法操作,得醚(C)。   
  ④水溶性生物碱的鉴定:取2 ml水液(C)用2%盐酸酸化至pH<3,分为四份作沉淀反应。若沉淀反应为阳性,则表明含水溶性生物碱。

4.实验记录格式
    各pH条件下的有机层和水层经生物碱沉淀试剂检查后以“一”代表负反应,以“+”、“++”、“+++”代表正反应及强弱程度记录于下表中,并推断含何类型生物碱。

大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴别编辑本段回目录

实验目的
(1)掌握蒽醌苷元的提取方法——酸水解法。
(2)掌握缓冲纸色谱的原理及基本操作技术。
(3)掌握pH梯度萃取法的原理及操作技术。
(4)通过大黄酚和大黄素甲醚的分离实验,熟悉柱色谱的操作技术。
(5)熟悉蒽醌类化合物的鉴定方法。   

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。具泻下、健胃、清热解毒等功效,因炮制方法不同,功效各有所主。大黄的主要成分为蒽醌衍生物,总量约3%~5%,以部分游离,大部分与葡萄糖结合成苷的形式存在。大黄的抗菌、抗感染有效成分为大黄酸、大黄素和芦荟大黄素,表现在对多种细菌有不同程度的抑菌作用。药理证明大黄能缩短凝血时间,止血的主要成分为大黄酚。大黄粗提物、大黄素或大黄酸对实验性肿瘤有抗癌活性。此外,结合型的蒽苷是泻下的有效成分,包括蒽醌苷和双蒽醌苷。另外,大黄还含有鞣酸类多元酚化合物,含量在10%~30%之间,具止泻作用,与蒽苷的泻下作用恰恰相反。

1.大黄中主要成分的物理性质
    (1)大黄酸(rhein):C15H8O6,黄色针状结晶,mp321℃~322℃,330℃分解。能溶于碱、吡啶,微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚,不溶于水。
(2)大黄素(emodin):C15Hl0O5,橙黄色针状结晶(乙醇),mp256℃~257℃(乙醇或冰乙酸),能升华。易溶于乙醇、碱液,微溶于乙醚、氯仿,不溶于水。
 
    (3)芦荟大黄素(aloe-emodin):C15Hl0O5,橙色针状结晶(甲苯),mp223℃~224℃。易溶于热乙醇,可溶于乙醚和苯,并呈黄色;溶于碱液呈绯色。
(4)大黄酚(chrysophano1):C15H10O4,橙黄色六方形或单斜形结晶(乙醇或苯),mpl96℃~197℃,能升华。易溶于沸乙醇,可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸,微溶于石油醚、冷乙醇,不溶于水。
    (5)大黄素甲醚(physcion):C16H12O5,砖红色单斜针状结晶,mp203℃~207℃(苯),溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯,微溶于醋酸及乙酸乙酯,不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
(6)羟基蒽醌苷类:大黄素甲醚葡萄糖苷(physcion monoglucoside),黄色针状结晶,mp235℃;芦荟大黄素葡萄糖苷(aloe-emodin monoglucoside),mp239℃;大黄素葡萄糖苷(emodin monoglucoside),浅黄色针状结晶,mpl90℃~191℃;大黄酸葡萄糖苷(rhein-8-monoglucoside),mp266℃~267℃;大黄酚葡萄糖苷(chrysophanol monoglucoside),mp245℃~246℃等。

2.基本原理
大黄中羟基葸醌类化合物多数以苷的形式存在,故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元,利用游离葸醌可溶于热氯仿的性质,用氯仿将它们提取出来。由于各羟基葸醌结构上的不同所表现的酸性不同,用pH梯度萃取法分离它们;大黄酚和大黄素甲醚酸性相近,利用其极性的差别,用柱色谱分离之。
   
3.操作
(1)提取分离流程

(2)总蒽醌苷元的提取   
大黄粗粉100 g,加20%硫酸溶液300 ml润湿,再加氯仿500 ml,回流提取2hr,稍冷后过滤,残渣弃去,氯仿提取液于分液漏斗中,分出酸水层,得氯仿提取液。

(3)蒽醌苷元的分离和精制
  1)蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验
为了验证分离所采用的萃取液是否合理,作如下缓冲纸色谱试验:取层析滤纸3 cm×12 cm,距下端2 cm处划一起始线,向上每隔1.5 cm划一平行线,在各条带上依pH由低至高顺次涂布实际所用的各缓冲液及碱液,涂布完后,将湿滤纸夹在两片干滤纸中吸至半干。取样品总蒽醌苷元氯仿提取液点在起始线上,用氯仿上行展开,将结果绘制在下面图中,并确定选择的萃取剂是否合理。

中药化学实验技术-层析分离方法

 
  2)分离与精制   
  ①大黄酸的分离和精制  将含有总蒽醌的氯仿液450 ml于1000 ml分液漏斗中,加pH 8缓冲液150 ml充分振摇,静置至彻底分层,分出碱水层置250 ml烧杯中,在搅拌下滴加20%盐酸至pH 3,待沉淀析出完全后,过滤,并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性,沉淀干燥后,样品加冰醋酸10 ml加热溶解,趁热过滤,滤液放置析晶,过滤,用少量冰醋酸淋洗结晶,得黄色针晶为大黄酸。
  ②大黄素的分离和精制  pH 8缓冲液萃取过的氯仿层,用pH 9.9缓冲液300 ml振摇萃取,静置至彻底分层后,分出碱水层,在搅拌下用20%盐酸酸化至pH 3,析出棕黄色沉淀,抽滤,水洗沉淀物至洗出液呈中性,沉淀经干燥后,用15 ml丙酮热溶,趁热过滤,滤液静置,析出橙色针晶,过滤后,用少量丙酮淋洗结晶,得大黄素。
  ③芦荟大黄素的分离与精制  pH 9.9萃取过的氯仿层再加5%碳酸钠-5%氢氧化钠(9:1)碱水液540 ml萃取,碱水层加盐酸酸化,析出的沉淀水洗,干燥,用10 ml乙酸乙酯精制,得黄色针晶的芦荟大黄素。
  ④大黄酚和大黄素甲醚的分离  萃取除去芦荟大黄素后余下的氯仿层,再用3%氢氧化钠溶液500 m1分二次萃取,至碱水层无色为止,合并碱水层,加盐酸酸化至pH 3,析出黄色沉淀,过滤,水洗至中性,干燥,为大黄酚和大黄素甲醚混合物,留作柱色谱分离的样品。余下氯仿液水洗至中性,蒸馏回收氯仿。
⑤硅胶柱色谱法分离大黄酚、大黄素-6-甲醚
装柱:用石油醚-乙酸乙酯(9.8:0.2)浸泡200~300目硅胶约20 g,搅拌均匀,尽量赶出气泡。一次性倒入1.8 cm X 28 cm 的层析柱中,轻轻敲打使硅胶均匀下沉,至硅胶界面不再下降为止。
上样:将离大黄酚和大黄素-6-甲醚的混合物用乙醇加热溶解,伴入少量硅胶,水浴60℃左右烘干,加到已装好的硅胶柱顶端,最后在样品带上盖上一层硅胶或棉花,以保护样品界面不受干扰。
洗脱:先用100 ml石油醚-乙酸乙酯(9.8:0.2)洗脱,至第一条黄色色带洗下来,再换用100 ml石油醚-乙酸乙酯(9.5:0.5)洗脱下第二条色带。

(4)鉴定
  1)蒽醌类成分化学鉴定   
  ①碱液试验  分别取各蒽醌结晶数毫克置于小试管中,加2%氢氧化钠溶液l ml,观察颜色变化。凡有互成邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色,其它羟基蒽醌呈红色。
  ②醋酸镁试验  分别取蒽醌结晶数毫克,置于小试管中,各加乙醇l ml使溶解,滴加0.5%醋酸镁乙醇溶液,观察颜色变化。   
 2)色谱鉴识   
  薄层板:硅胶G—CMC—Na板。  
点样:提取的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的氯仿溶液及各对照品氯仿溶液。   
  展开剂:石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液。
  展开方式:上行展开。
  显色:在可见光下观察,记录黄色斑点出现的位置,然后用浓氨水熏或喷5%醋酸镁甲醇溶液,斑点显红色。
  观察记录:记录图谱并计算Rf值。 

灰毛寄生叶中槲皮苷和广寄生苷的提取、分离及鉴定编辑本段回目录

实验目的
(1)掌握聚酰胺柱层析分离黄酮类化合物的原理和方法。
(2)巩固薄层层析的操作技术。
(3)熟悉黄酮类化合物的光谱分析。
灰毛寄生为桑寄生科植物Taxillus sutchenensis var.duclouxii (leconlte)Kui的干叶,为中药桑寄生主流品种之——四川寄生的变种,产区作桑寄生用,有降压镇静等药理作用,灰毛寄生叶含多种黄酮类化合物。
灰毛寄生叶中已知成分的物理性质如下:

中药化学实验技术-层析分离方法

 
白色丝状结晶(乙醇),熔点175℃~177℃,溶于热水、乙醇、丙酮,微溶于冷水和乙醚。

1.基本原理
聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物,分子中含有丰富的酰胺基,可与黄酮类化合物形成氢键结合而被吸附。化合物分子中的酚羟基数目越多,则吸附力越强,芳香核、共轭双键多的吸附力也大。易形成分子内氢键的化合物,会使化合物的吸附力减少。本实验利用不同结构的黄酮类化合物与聚酰胺形成氢键的能力不同,采用聚酰胺柱层析法进行分离。

2.操作
(1)预试:按“中药化学成分鉴别实验中黄酮类的鉴别”项下的方法进行。
  •  Mg+HCl反应
  •  A1C13反应
  •  FeCl3反应 
  若结果为明显阳性,继续以下实验。
(2)提取   
  ①总黄酮的提取:称取灰毛寄生叶40 g粉碎,置500 ml圆底烧瓶中,加入95%乙醇100 ml,70℃水浴温浸1小时,倾出上清液,残渣加95%乙醇80 ml重复提取2次,每次1小时,合并3次提取液,充分静置后过滤,滤除沉淀物,滤液用旋转蒸发仪浓缩得浸膏。醇浸膏用60℃的饱和食盐水溶解,每次约8 ml~10 ml,共5~6次,至盐水溶解液几乎无色,合并食盐水溶液,用乙酸乙酯60 ml萃取约4次,最后一次萃取液应对Mg+HCl反应显色不明显,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂,得总黄酮提取物。黄酮提取物用热乙醇约2 ml溶解后与0.3 g聚酰胺(80目~100目)拌合,挥尽乙醇作为柱层析分离用样品。 
  ②总黄酮的分离——聚酰胺柱层析   
  装柱:取1.8 cm×28 cm玻璃层析柱一根,称取6 g(80目~100目)聚酰胺,加水60 ml浸泡半小时,用水为溶剂湿法装柱。
  上样:制备的样品加入约5 ml水浸泡后上于柱顶。
洗脱:先用约2倍量柱体积水洗脱,除去糖类成分,再使用30%、50%乙醇依次洗脱,洗脱液每份收集10~20 ml,柱上出现两主色带,第一色带(30%乙醇洗脱)几乎被洗脱完全后,换用50%乙醇洗脱至第二色带洗脱完全,停止洗脱。收集的组分经薄层层析检查,合并相同组分,减压回收各单一组分溶剂,甲醇重结晶,分别得结晶I和Ⅱ。

3.鉴定
(1)化学反应  
  α-萘酚反应检测糖类化合物
  Mg+HC1反应
  A1C13反应     检测黄酮类化合物
(2)层析鉴定
  样品:A标准品:槲皮苷,广寄生苷,儿茶素,槲皮素
        B结晶I,C结晶Ⅱ,D总黄酮乙醇液
a.硅胶薄层层析
  展开剂:氯仿-丙酮-甲酸(5:3:1)
  显色剂:1%三氯化铁-1%铁氰化钾(临用时等体积混合)
b.聚酰胺薄膜层析   
  展开剂:95%乙醇
  显色剂:同上
(3)测定熔点
(4)UV,IR,NMR图谱分析
结晶I:IRcm-1  3274, 1658, 1607, 1500, 1204, 1171, 1145, 1099, 847, 788.
UVλmaxnm(MeOH)  256, 265, 301sh, 350
1H-NMR δ ppm  6.16 (IH, d, J=2.0Hz), 6.35 (1H, d, J=2.0Hz),
6.80 (1H, d, J=8.0Hz), 7.28 (1H, d, J=8.0Hz),
7.20 (IH, d, J=2.0Hz), 5.24 (1H, d, J=8.0Hz),
0.84 (3H, d, J=6.5Hz)
结晶 II: IRcm-1  3334, 1652, 1610, 1504, 1202, 1115, 1071, 1024, 882, 841
826, 721
UVλmaxnm (MeOH)  255, 265, 296sh, 354
1H-NMR  δ ppm      6.16 (1H, d, J=2.0Hz), 6.35 (IH, d,.J=2.0Hz),
6.80(1H, d, J=8.0Hz), 7.32 (1H, d, J=8.0Hz),
7.24 (IH, d, J=2.0Hz), 5.56 (1H, d, J=l.5Hz)

芸香苷的提取、分离和鉴定编辑本段回目录

实验目的
(1) 熟悉利用化合物的物理、化学性质对其进行分析和鉴定的方法。
(2) 掌握紫外光谱在黄酮类化合物结构鉴定中的方法和应用。

槐米系豆科属植物槐树Sophora japonica L.的花蕾,历来作为止血药,治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血,并有清肝泻火,治疗肝热目赤,头痛眩晕的功能。其主要化学成分为芦丁,含量高达12%~20%,芸香苷广泛存在于植物中,现已发现含有芸香苷的植物多达70种以上,尤以槐米和荞麦中含量最高。药理实验证明芸香苷有调节毛细血管渗透作用,临床上用作毛细血管性止血药,常作为高血压症的辅助用药。

1.槐米中主要成分的物理性质
    (1)芸香苷(芦丁,rutin):C27H30O16•3H2O,淡黄色针状结晶,mpl74℃~178℃,无水物为188℃~190℃。溶解度:冷水中1:8000,热水中1:200,冷乙醇中1:300,热乙醇中1:30,冷吡啶中1:12,微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、氯仿、石油醚等溶剂。易溶于碱液,呈黄色,酸化后又析出,可溶于硫酸和盐酸,呈棕黄色,加水稀释又析出。
    (2)槲皮素(quercetin):C15H10O7•2H2O,黄色结晶,mp313℃~314℃,无水物为316℃。溶解度:冷乙醇中1:290,沸乙醇中1:23,可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂,不溶于水、乙醚、苯、氯仿,石油醚。
 
2.操作
(1)芸香苷的提取-水提取法
称取槐花米粗粉20 g(压碎),加沸水300 ml,加热煮沸30 min,纱布趁热过滤,残渣同法再操作一次,合并两次滤液,室温放置析晶,待全部析出后,减压抽滤,用蒸馏水洗涤芸香苷结晶,抽干,得粗制芸香苷,置空气中干燥后,称重。
(2)芸香苷的精制
取粗制芸香苷2 g,加蒸馏水400 ml,煮沸至芸香苷全部溶解,趁热抽滤,冷却后即可析出晶体,抽滤,得芸香苷精制品,置空气中干燥后,称重。
(3)芸香苷的水解
取精制芸香苷1 g,研细后置于250 ml圆底烧瓶中,加入2%硫酸100 ml,加热回流30 min,瓶中混浊液逐渐变为澄清的棕黄色液体,最后生成鲜黄色沉淀。放冷沉淀,抽滤,保存滤液(应为澄清无色液体),用做糖的检查,沉淀物为芸香苷苷元(槲皮素),用蒸馏水洗至中性,抽干水分,晾干,称重。粗制槲皮素再用50%乙醇重结晶得精制的含2分子结晶水的槲皮素。
取芸香苷水解后的滤液10 ml,加饱和氢氧化钡溶液(或碳酸钙粉末)中和至中性,滤去白色的硫酸钡沉淀,滤液水浴60℃浓缩至2~3 ml,加2~3 ml乙醇溶解,作为糖的供试液。
 

(4)槲皮素乙酰化物的制备
取槲皮素100 mg,置于50 ml圆底烧瓶中,加入2 ml无水吡啶,于水浴上加热回流,使其完全溶解,再加入1 ml醋酐,摇匀,水浴上加热回流30 min,放冷,将反应液在搅拌下倾入100 ml冰水中,一直搅拌至油滴消失,固体沉淀析出,抽滤析出的白色沉淀用水洗至中性,干燥,再用95%乙醇重结晶,得针状晶体,测定其熔点,并与文献报道的五乙酰槲皮素的熔点(193℃~195℃)对比。

3.鉴定 
(1)呈色反应
    取芸香苷及槲皮素精品约10 mg,各用5 ml乙醇溶解,制成样品溶液,按下列方法进行试验,比较苷元和苷的反应情况。
    a. Molish反应  取样品溶液l ml,加10%α-萘酚溶液0.5 ml,振摇后斜置试管,沿管壁滴加0.5 ml硫酸,静置,观察并记录液面交界处颜色变化。
    b. 盐酸-镁粉反应  芸香苷与槲皮素溶液分别置于两试管中,加入金属镁粉少许,盐酸2滴~3滴,观察并记录颜色变化。   
    c. 醋酸镁纸片反应  取两张滤纸条,分别滴两滴芸香苷、槲皮素的乙醇溶液,然后各加1%醋酸镁甲醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。 
    d. 三氯化铝纸片反应  在两张滤纸条上分别滴加芸香苷、槲皮素醇溶液后,各加1%三氯化铝乙醇溶液两滴,观察颜色变化,记录现象。
    e. 锆-柠檬酸反应  取样品溶液2 ml,加入2%二氯氧锆甲醇溶液3滴~4摘,观察颜色,然后加入2%柠檬酸甲醇溶液3滴~4滴,观察并记录颜色变化。
(2)色谱鉴定   
a. 芸香苷和槲皮素的纸色谱
    层析材料:定性滤纸。
    点  样:提取的槲皮素承芸香苷的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。
    展开剂:正丁醇-醋酸-水(4:1:5)上层溶液。
    展开方式:预饱和后,上行展开。   
    显  色:喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外光灯、(365nm)下检视色斑的变化。
    观察记录:记录图谱及斑点颜色。
b. 芸香苷与槲皮素的聚酰胺色谱
    层析材料:聚酰胺薄膜。
    点  样:提取的芸香苷与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。   
    展开剂:乙醇-水(7:3)或甲醇-水(8:2)。
    展开方式:上行展开。   
    显  色:喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外灯光(365nm)下检视色斑的变化。   
观察记录:记录图谱及斑色颜色。
c. 糖的色谱鉴定   
    层析材料:定性滤纸。
    点  样:糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。
    展开剂:正丁醇-醋酸-水(4:1:5)上层溶液。
    展开方式:上行展开。
    显  色:苯胺-邻苯二甲酸试液,喷洒后先用电吹风冷吹至于,再吹热风至出现斑点为止。
    观察记录:记录图谱及斑点颜色。
(3)芸香苷的紫外光谱测定
a. 试液配制   
    ①无水甲醇  用分析纯甲醇重蒸馏即得。
    ②甲醇钠溶液  取0.25 g金属钠切碎,小心加入10 ml无水甲醇(此液置玻璃瓶中,用橡皮塞密封)。
    ③三氯化铝溶液  取1 g三氯化铝(呈黄绿色),小心加入无水甲醇20 ml,放置24 h,全溶即得。   
    ④醋酸钠  试剂级无水粉末醋酸钠。
    ⑤硼酸饱和溶液:将试剂级无水硼酸加入适量无水甲醇制成饱和溶液。
(上述各试液可贮存6个月)
   b. 测定方法  精密称取芸香苷1 mg,用无水甲醇溶解并稀释至100 rnl(10μg/m1),制成样品液。
    ①样品液(甲醇溶液)光谱  取样品液3 ml置于石英杯中,在200nm~400nm内扫描。重复操作一次,记录紫外光谱数据。
    ②甲醇钠光谱  取样品液3 ml置于石英杯中,加入甲醇钠溶液5~7滴,立即测定。放置5 min后再测定一次。
    ③三氯化铝光谱  在盛有样品液的石英杯中滴入6滴三氯化铝溶液,放置l min后测定,然后加入3滴盐酸溶液(HCl-H2O=1:1),再进行测定。
    ④醋酸钠光谱  取样品液约3 ml,加入过量的无水醋酸钠固体,摇匀(杯底约剩有2 mm厚的醋酸钠),加入醋酸钠后2 min进行测定,5 min~10 min后再测定一次。
   ⑤醋酸钠/硼酸光谱
  方法I:在盛有醋酸钠的样品液的石英杯中,加入足够量的无水硼砂粉末使成饱和的溶液,进行测定(本法适用于在加入醋酸钠5 min后无分解现象的样品)。
  方法II:于3 m1样品液中加入5滴硼酸溶液,然后迅速加入无水醋酸钠粉末饱和,摇匀,放置片刻,待没有气泡,立即进行测定。

4.附注
    ①提取过程中,加入硼砂的目的是为了保护芸香苷分子中邻二酚羟基,以减少其氧化,并使其不与钙离子结合(钙盐络合物不溶于水),使芸香苷不受损失,提高产率。
②加入石灰乳
即可以达到碱性溶解提取的目的,还可以除去槐花米中的多糖类、粘液质等,但碱性不宜过高(pH不超过10),因为在强碱性条件下煮沸,时向稍长就可促使芸香苷水解破坏,降低产率。
    ③芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱,可用圆形滤纸,采用径向展开,一次完成。展开后,将滤纸剪开,苷、苷元用三氯化铝试液显色,糖用苯胺-邻苯二甲酸试液显色。
④芸香苷紫外光谱图    

中药化学实验技术-层析分离方法


 

栀子中京尼平苷的提取和分离纯化编辑本段回目录

实验目的
(1)掌握大孔吸附树脂柱层析分离化合物的原理和方法。   
(2)了解利用氧化镁吸附分离化合物的方法。
(3)巩固薄层层析的操作技术。

    栀于是茜草科植物山栀Gardenia asminoids Ellis的果实。性苦寒,无毒。能清热泻火,凉血。主治热病虚烦不眠、黄疸、目赤、咽痛、尿血、扭伤肿痛等。主要化学成分有三类:环烯醚萜苷类、有机酸类及色素类等。栀子中含有大量的环烯醚萜类化合物,主要是京尼平苷,又称栀子苷(geniposide),具有抗炎、解热、利胆和轻泻等作用。
京尼平苷,C17H24O10,无色针晶(四氯化碳),mpl61℃~162℃。味苦,溶于乙醇、水,微溶于乙酸乙酯、丙酮、乙醚、四氯化碳,不溶于氯仿、石油醚。
 
京尼平苷

1.基本原理
    大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂,也是一种亲脂性物质。利用大孔吸附树脂吸附极性较小的化合物而除去糖类等水溶性杂质,再通过梯度醇洗脱达到分离纯化的目的。
    氧化镁是常用的吸附剂之一,利用吸附法对中药成分进行分离纯化有两种类型。一种是吸附要分离得到的物质,不吸附其他杂质;另—种是吸附杂质。本实验是利用氧化镁吸附所需物质,再用洗脱剂洗脱下来。

2.提取分离流程

中药化学实验技术-层析分离方法

3.操作   
(1)提取:取栀子粉100 g,置1000 ml圆底烧瓶中,加入200 ml石油醚回流提取0.5小时,抽滤。药渣加95%乙醇200 ml回流提取3次,每次30 min,合并提取液,减压回收乙醇得醇浸膏。浸膏用水浴60℃加热溶解,抽滤,滤液可用于做下面两个实验之一。
①大孔吸附树脂柱层析
  预处理:取1.8cm×28 cm玻璃层析柱一根,称取25 g D101大孔吸附树脂,加水浸湿30 min,倒入柱中。用95%乙醇洗柱,至流出液加2倍水不浑浊为止,再用水洗柱除尽乙醇,备用。
  上样:制备好的样品加入柱顶。
洗脱:先用水洗脱,流出液用molish反应检测糖类,至反应检测无糖类成分或显色很弱时,停止洗脱。再用20%乙醇、50%乙醇依次洗脱,molish反应呈阴性时更换洗脱液。减压浓缩收集的三个组分,并与标准品经TLC检测,京尼平苷主要集中于20%醇洗脱液中,即得京尼平苷浓缩液。另外,水中还有少量京尼平苷,50%乙醇洗脱液中则没有。
②氧化镁吸附   
将滤液倒入蒸发皿中,加入氧化镁30 g,60℃水浴蒸干,得吸附有样品的氧化镁粉末。再将氧化镁装入层析柱中,用乙酸乙酯洗脱500 ml,减压回收溶剂,浓缩得京尼平苷粗品。在乙酸乙酯-丙酮(1:1)中重结晶得京尼平苷纯品。

硅胶薄层层析   
  展开剂:乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:1:1 or 5:5:1:1)
  显色剂:a 50%硫酸乙醇溶液;
          b 艾氏试剂:对二甲氨基苯甲醛0.25 g溶于50 g冰醋酸、
5 g 85%磷酸和20 ml水中,棕色瓶保存。

穿心莲内酯的提取、分离、鉴定与亚硫酸氢钠加成物的制备编辑本段回目录

实验目的
(1)掌握从穿心莲中提取、分离穿心莲内酯的操作方法。
(2)学习去除叶绿素的方法。
(3)熟悉α,β-不饱和内酯类成分的识别反应与薄层鉴定。   
(4)学习穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物的制备。
    穿心莲系爵床科植物穿心莲Andrographis Paniculata (Burm.f.) Ness的全草。主要产于我国南方各省,具清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛功能,用于治疗急性菌痢、肠胃炎,感冒发热、咽喉炎、尿路感染等。穿心莲中含有多种苦味素,属二萜类化合物,主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等,前二者是穿心莲抗菌消炎的主要有效成分。据报道,穿心莲内酯能抑制肺炎球菌、甲链球菌及卡那球菌。对细菌性痢疾,上呼吸道感染、扁桃体炎等有显著疗效。临床上将穿心莲内酯制成亚硫酸氢钠加成物、丁二酸半酯的钾盐或磺酸钠衍生物,以增加它们在水中的溶解度,用于制备浓度较高的注射剂,提高疗效。   
    穿心莲中主要的有效成分:   
    (1)穿心莲内酯(andrographolide):C20H30O5,无色方晶,mp 230~232℃。味极苦,可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶,微溶于氯仿、乙醚,难溶于水及石油醚。
    (2)新穿心莲内酯(neo-andrographolide):C26H40O8,无色柱状结晶,mp l67~169℃。无苦味,可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶,微溶于氯仿和水,不溶于乙醚、石油醚。   
    (3)脱氧穿心莲内酯(14-deoxyandrographolide):C20H30O4,无色片状或长方形结晶,mp l75~176.5℃。味稍苦,可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、氯仿、乙醚和苯,微溶于水。
    (4)脱水穿心莲内酯(14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide):C20H28O4,无色针状结晶,mp 203~204℃。易溶于乙醇、丙酮,可溶于氯仿,微溶于苯,几乎不溶于水。本品与脱氧穿心莲内酯的极性相似,但用硝酸银溶液饱和的薄层板进行层析,可以将它们分开。
此外,穿心莲还含有高穿心莲内酯、穿心莲烷、甾醇类、黄酮类、甾体皂苷、糖类、叶绿素和缩合鞣质等。
1.基本原理   
穿心莲中的内酯类成分易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂,故利用此性质选用乙醇提取之;穿心莲中含有大量叶绿素,可用活性炭脱色法除去叶绿素杂质;利用穿心莲内酯与脱氧穿心莲内酯在氯仿中溶解度不同,初步将二者分离;利用穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯结构上的差异,而造成的极性不同,用氧化铝柱分离之。将穿心莲内酯制成亚硫酸氢钠加成物以增加其在水中的溶解度,用于制备注射剂。

2.提取分离流程如下

中药化学实验技术-层析分离方法

3.操作
(1)提取
  a.冷浸法:取穿心莲叶粗粉200 g,用80%乙醇浸润1h后装入容器中,分次加入5倍和4倍量(V/W)的80%乙醇浸渍,每次浸2天,合并2次浸出液,浓缩至500 ml左右,即为内酯类成分总浓缩液。  
  b.超声波振荡提取:取穿心莲叶粗粉200 g,用10倍量(V/W)80%乙醇分3次进行超声波振荡提取,每次30 min。合并3次提取液,回收乙醇至500 ml左右,即为内酯类成分总浓缩液。
(2)脱色
    将上述内酯类成分总浓缩液,加入原料量15%~20%的活性炭,加热回流30 min,趁热过滤,并用少量热乙醇分2次洗涤炭层,合并滤液与洗液,浓缩至原料量的10%(V/W),室温放置1~2天使析晶。滤取结晶,用少量95%乙醇淋洗粗晶,母液与洗液合并,再浓缩,放置析晶,滤取第二次粗晶,留作柱色谱样品。
(3)分离、精制
  a.氯仿法
    取穿心莲内酯粗晶,称重,加入5倍量氯仿(V/W)振摇,冷浸放置1h(或加入3倍量氯仿(V/W)回流10 min)过滤,不溶部分再用热氯仿洗涤两次,氯仿中含有脱氧穿心莲内酯等成分,不溶解部分为穿心莲内酯。将此不溶物于50℃下干燥后,再加15倍(V/W)95%乙醇,加热回流溶解,稍冷后加入溶液体积1%的活性炭继续回流30 min,趁热过滤,滤液回收乙醇至半,放冷析晶,抽滤得精制穿心莲内酯,称重,计算得率。
  b.氧化铝柱色谱法
    取色谱用中性氧化铝6 g,加入8%水振摇均匀使活度呈W级,加入氯仿,搅拌,另取干净色谱柱(1.8 cm×28 cm),打开柱下口活塞,湿法装柱。称取穿心莲粗晶20 mg置蒸发皿内,用刮刀压碎后,加0.4 ml乙醇溶解,再加入中性氧化铝约0.3 g,拌匀后在红外灯下干燥,压碎,加到柱顶,呈均匀薄层带,再加小块棉花于柱顶,防止加洗脱剂时冲坏柱面。
    按梯度洗脱,先以氯仿洗脱,用小三角瓶收集洗脱液,通过硅胶板上检查内酯成分出现时(用毛细管取洗脱液点在硅胶薄层板上,用Kedde试剂检出,加热后出现紫色斑点)开始收集第一流分,每份10 ml。继以氯仿-无水乙醇(20:0.1)、氯仿-无水乙醇(9.6:0.4)、无水乙醇、50%乙醇洗脱,收集流分20~22份,分别在水浴上浓缩各流分至小体积,硅胶H-CMC-Na板上检查,并用穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯对照品对照,相同流分合并,水浴上蒸干,用95%乙醇重结晶,可得穿心莲内酯纯品,称重,测熔点。
4.穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物的制备   
    该加成物为白色至类白色无定形粉末,mp 226~227℃(液化并分解),微具苦味,具有引湿性,易溶于水,可溶于甲醇或乙醇,微溶于氯仿。
(1)反应原理

中药化学实验技术-层析分离方法

(2)工艺
取穿心莲内酯精制品0.5 g,置50 ml圆底烧瓶中,加95%乙醇5 ml及计算量的亚硫酸氢钠溶液(配成4%亚硫酸氢钠水溶液),加热回流30 min,移入蒸发皿中,水浴蒸去乙醇至无醇味,再加蒸馏水5 ml溶解,冷却,过滤,滤液用氯仿洗涤2~3次,每次2 ml,水层置水浴上浓缩至约5 ml,放置析晶或抽松,得白色穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物,测熔点。 
(3)工艺说明  
理论与实践证明,穿心莲内酯与亚硫酸氢钠加成摩尔比为1:1。因此,穿心莲内酯350 g,需要亚硫酸氢钠104 g。但是,由于亚硫酸氢钠不稳定,含量易降低,故需新鲜配制,且要求原料含量在95%以上,并按100%换算成实际需要量,因此,实验室制备时宜稍多加亚硫酸氢钠的溶液。

5.穿心莲内酯及其加成物的鉴定
(1)呈色反应
  a.异羟肟酸铁反应:取穿心莲内酯结晶数毫克,加乙醇l ml溶解,加7%盐酸羟胺甲醇溶液2~3滴,加10%氢氧化钾甲醇溶液1~2滴使呈碱性,于水浴上加热2 min,放冷,加稀盐酸使呈酸性,加1%三氯化铁试液1~2滴,混匀,呈紫红色。
  b.Legal反应:取穿心莲内酪结晶少许,加乙醇0.5 ml使溶解,加0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液2滴,10%氢氧化钠溶液1滴,呈紫色。
  c.Kedde反应:取穿心莲内酯结晶少许,加乙醇0.5 ml溶解,加Kedde试剂2滴,呈紫色。  
(2)色谱鉴定   
薄层板:硅胶H-CMC-Na薄层板。
点样:自制的穿心莲内酯乙醇液;穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物
水溶液及穿心莲内酯对照品乙醇溶液。
展开剂:①氯仿-甲醇(9:1) ②氯仿-正丁醇-甲醇(2:1:2)。
展开方式:上行展开。
显色:喷Kedde试剂,加热显色。
观察记录:记录图谱并计算Rf值。

6.附注
  ①穿心莲内酯类化合物性质极不稳定,易氧化、聚合而树脂化,因此所用药材应是当年产的,且未受潮变质的茎叶部分,否则内酯含量明显降低。
  ②穿心莲内酯类的提取也可用95%乙醇,据文献报道,提取率以60%~80%乙醇为最好。
  ③提取方法以超声波振荡法最优,省时。浓缩析晶时脂溶性杂质少,易得到黄色结晶,得率高。也可用95%乙醇加热回流提取,但杂质较多,给下一步析晶和精制带来困难。
  ④母液再浓缩后,可缓慢滴加水约5 ml,以利于析晶,但加水要缓慢,否则引起乳化。若已乳化,除静置分层外,也可在水浴上适当加热,过滤,再放置析晶。
 ⑤制备亚硫酸氢钠加成物肘,若穿心莲内酯精制品量不足0.5 g,可按比例相应减少95%乙醇及亚硫酸氢钠的量,0.05g~0.1g穿心莲内酯即可进行加成物的制备。

齐墩果酸的提取、分离及鉴定编辑本段回目录

实验目的
(1)掌握三萜皂苷元的提取、分离和鉴定技术,熟悉三萜皂苷的性质。
(2)掌握两相溶剂水解方法。

齐墩果酸是一种广谱抗变态反应药,对I、II型变态反应均有抑制作用。它又是一种良好的免疫调节剂,具有抑制肿瘤,降低转氨酶,防治肝炎、肝硬化,降血糖,升白细胞和增强机体免疫功能等功效。齐墩果酸属五环三萜类化合物,广泛分布于植物界,已报道其以游离态、酯、苷或兼有的形式存在于150多种植物中,而多数是以苷的形式存在。但含齐墩果酸的量超过10%的甚少。从刺五加、龙牙楤木中提得率超过10%,纯度达95%以上,是理想的药用资源。
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。为常用的扶正固本中药。药理研究表明其促进免疫的主要有效成分为齐墩果酸、熊果酸及乙酰齐墩果酸。齐墩果酸以游离态和结合成苷的形式同存于女贞子中。经检测发现其齐墩果酸含量以幼果期(8月)含量最高,可达8.04%,随着发育成熟下降到2.5%左右。其在果实中的含量分布为外中果皮>全果实>内果皮>种仁。女贞子还含橄榄苦苷、D-甘露醇、硬脂酸、植物蜡等。
女贞子中主要有效成分:
(1)齐墩果酸(oleanolic acid):C30H48O3,白色针状结晶(95%乙醇),mp 305~306℃。可溶于热甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等,不溶于水。
(2)熊果酸(ursolic acid):C30H48O3,白色针状结晶(95%乙醇),mp 286~287℃。易溶于二氧六环、吡啶。可溶于热乙醇,微溶于苯、氯仿、乙醚,不溶于水。
(3)乙酰齐墩果酸(acetyl oleanolic acid):C32H50O5,白色簇晶。Mp 258℃~260℃。溶于氯仿、乙醚、无水乙醇,不溶于水。
1.基本原理
    根据女贞子中齐墩果酸以游离型和结合成苷的形式共存于果实中,采用酸水解,氯仿萃取同步法提取齐墩果酸。 
2.操作
(1)提取
    称取女贞子果皮粗粉50 g,置于圆底烧瓶内,加15%盐酸溶液350 ml,氯仿250 ml,70℃水浴回流水解2h,过滤,分取氯仿提取液(用水洗至中性,用无水硫酸钠脱水干燥、过滤)另存。药渣用水洗至中性,抽干,干燥药渣至含水量小于10%。将干燥药渣置于圆底烧瓶内,加氯仿250 ml回流1h,合并二次氯仿提取液,取出2 ml留待薄层鉴识,其余减压回收氯仿至糖浆状,趁热转移至烧杯中,冷后成半固状物。   
(2)分离与精制   
    方法1:取上述半固状物,以少量苯洗涤.除去脂溶性较大的成分,即有固体析出,抽干,得浅黄色析出物。用1:100倍量(W/V)95%乙醇回流10 min,过滤,滤液浓缩至小体积,放置,析出粗晶,抽滤得齐墩果酸粗品。反复用90%乙醇重结晶,可得较纯的齐墩果酸。
    方法2:同方法1用苯处理得浅黄色析出物,加10倍量5%氢氧化钠溶液煮沸10 min,放冷后抽滤,适量热水洗涤1~2次,抽干得类白色析出物,用95%乙醇回流溶解,趁热过滤,盐酸调至pH l~2,放置析晶。抽滤得齐墩果酸粗品,用正己烷-乙醇(1:1)重结晶,可得较纯的齐墩果酸。
(3)鉴定
  a.呈色反应
    取齐墩果酸少许置试管中,加醋酐l ml,使溶解后,沿试管壁加硫酸数滴,在两液层交界处,出现紫红色环。
  b.薄层色谱鉴别   
    薄层板:硅胶G-CMG-Na板
点样:女贞子氯仿提取液、自制齐墩果酸乙醇溶液、齐墩果酸对照品乙醇溶液(1 mg/ml)。
    展开剂:氯仿-丙酮(95:5)、环己烷-乙酸乙酯(8:2)任选一种。
    显色:喷10% 硫酸甲醇溶液,105℃烘至显色,日光和紫外光灯(365nm)下检识。
    观察记录:记录图谱及斑点颜色。
3.附注
   ①女贞子中齐墩果酸的含量因采收季节、产地不同有较大差异,可根据原料含量酌增取材量。   
  ②用苯洗涤应控制用量,以防主成分的损失,也可用适量石油醚替代。

茶叶中咖啡因的提取、分离及鉴定编辑本段回目录

实验目的
(1)学习用升华法分离精制化合物的方法。
(2)巩固连续提取操作。

    茶叶为山茶科植物茶Camellia sinensis O.Ktze等植物的干燥叶枝,有提神、利尿等功效。其所含化学成分为生物碱、黄酮类、维生素、麦角甾醇、挥发油等。其中生物碱咖啡因对中枢神经系统有广泛的兴奋作用,还有较弱的兴奋心脏和利尿的作用。   
    茶叶中的主要成分:
  (1)咖啡因(caffeine)C8H10N4O2,白色结晶。mp 238℃,178℃升华。溶于热水、热乙醇、氯仿,较难溶于醚和苯。
  (2)茶碱(theophylline)C7H8N4O2,白色结晶,mp 270~274℃(含一分子结晶水),微溶于水、氯仿,溶于热水、碱水和稀酸水。
1.基本原理
利用咖啡因具有升华的性质,采用升华法对其进行分离纯化。对茶叶中咖啡因的提取常以乙醇等为溶剂,用连续提取装置进行固液萃取后,蒸除溶剂,得到粗咖啡因。再利用升华法进一步纯化而得。   
2.操作
(1)预试:按“中药化学成分鉴别实验中生物碱的鉴别”项下的实验方法进行。若结果产生明显沉淀,则继续以下实验。
(2)提取:取茶叶20 g加95%乙醇150 ml,置连续提取器中,水浴加热进行提取,直至提取液作生物碱沉淀反应呈阴性。回收溶剂至接收瓶内液体剩约5 ml。将此浓缩提取液全部转入蒸发皿中,加入生石灰3 g~4 g,搅拌下水浴挥尽溶剂。
(3)纯化:取一片刺满小孔的圆形滤纸,置于上述蒸发皿上,于滤纸上再盖一只内径略小于蒸发皿的玻璃漏斗,漏斗尾部再盖一小烧杯。将此装置小心放在石棉网上加热至升华完毕。稍冷后小心将装置移出,待其温度降至室温后,小心用钢刀收集升华物。蒸发皿内残渣搅拌后,同前再进行一次升华操作,合并升华物,称量。

3.鉴定
(1)测定熔点
(2)化学反应——沉淀反应
①检品溶液的制备:取少许升华物,用1%盐酸2 ml溶解,即得。
②鉴别反应:
    碘化汞钾试剂、碘化铋钾试剂、碘碘化钾试剂、硅钨酸试剂。

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