问:想从酵母提取质粒,转化大肠杆菌,按分子克隆的方法,可能都线性化了,转化率为0,请问有什么好的办法? 答:以下是我的方法,曾提过数百个,好像转化效率还可以,基本上都提出来了。 个人体会是Lyticase的活性要好,而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧,u see,酵母质粒所以不好提,就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁,再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题,所以破壁一定要充分。其次吗?感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有,如果担心酵母细胞的活性问题,也可以活化一下再提,不过好象我的实验中这项不是问题.......哈哈…. 详细步骤: 1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中。 2、每管加10μl的裂解液(Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存),涡流混匀。 3、37℃,200-250r/m,30-60min。 4、每管加10 μl 20%SDS,涡流1min。 5、–20℃冻存过夜。 6、室温下融解后,涡流混匀。 7、质粒提取。 8、转化(要求:4℃预冷) |
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