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标签: 酵母 质粒 提取 方法

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问:想从酵母提取质粒,转化大肠杆菌,按分子克隆的方法,可能都线性化了,转化率为0,请问有什么好的办法?

答:以下是我的方法,曾提过数百个,好像转化效率还可以,基本上都提出来了。

个人体会是Lyticase的活性要好,而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧,u see,酵母质粒所以不好提,就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁,再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题,所以破壁一定要充分。其次吗?感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有,如果担心酵母细胞的活性问题,也可以活化一下再提,不过好象我的实验中这项不是问题.......哈哈….

详细步骤:

1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中。

2、每管加10μl的裂解液(Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存),涡流混匀。

3、37℃,200-250r/m,30-60min。

4、每管加10 μl 20%SDS,涡流1min。

5、–20℃冻存过夜。

6、室温下融解后,涡流混匀。

7、质粒提取。
  7.1  1.5ml离心管加TE Buf至200μl的(pH7.0)
  7.2  200μl酚,涡流5min后,4℃,14000r/m离心10min。
  7.3  取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中。
  7.4  等体积酚氯仿,涡流5min。
  7.5  4℃,14000r/m离心10min。
  7.6  取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿,涡流混匀。
  7.7  4℃,14000r/m离心10min。
  7.8  取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中。
  7.9  8μl 10M NH4Ac和500μl 95%~100%的乙醇。
  7.10  –70℃,1h。
  7.11  4℃,14000r/m离心10min。
  7.12  弃上清,空气中干燥。
  7.13  10μl H2O悬浮细胞。

8、转化(要求:4℃预冷)
  8.1  冰上融化感受态细胞(感受态细胞的制备见分子克隆啦)Top10f’。
  8.2  加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中,枪头轻轻吹打混匀。
  8.3  冰上孵育30min。
  8.4  42℃,45S~50S。
  8.5  冰上孵育2min后,加1ml LB。
  8.6  37℃,1h,250r/m.
  8.7  2500r/m,5min,RT。
  8.8  弃上清,在剩余的溶液中悬细胞。
  8.9  接种LB/Amp板,37℃,倒置培养24h。
  8.10  挑克隆,过夜培养,常规碱裂解法提质粒

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